Transcript Genotipificación

Decisiones
Detección
Diagnóstico
Investigación
Terapia
TECNICAS DE ESTUDIO
Silvia Juliana Serrano Gómez B.Sc, M.Sc
Fundación para la Investigación Clínica y Molecular Aplicada del Cáncer - FICMAC
Que es genotipificacion?
• Genoma: “Set completo de información genética encontrada en una célula.
En humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas”
• Alelo: “Diferentes formas o variantes de una gen”
• Genotipo: “Conjunto particular de alelos para todos los genes portados por
un individuo”
Genotipificación Determinación del genotipo de una persona
Metodos
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
• Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
• (simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
Eventos en la Replicación del DNA:
•
Apertura de las cadenas (origen de replicación)
•
Colocación de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
•
Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
•
Eliminación de los iniciadores de RNA.
•
Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
• Componentes
– Desoxinucleotidos (dNTPs)  dATP, dTTP, dGTP,
dCTP
– Enzima  Taq (Thermus aquaticus)
– Iniciadores (Primers)  Complementarios a la cadena
de ADN
– ADN molde  Concentracion de 20ng
Desoxinucleotidos (dNTPs)
Bases Nitrogenadas del ADN
Union por puentes de hidrogeno
Adenina-Timina
Guanina-Citocina
ADN polimerasa
Estable a altas
temperaturas
Thermus
aquaticus
Thermococcus
litoralis
Enzima de 95kd.
Actividad
Exonucleasa: 5’—3’
Actuar altas temperaturas
PRIMERS
(Iniciadores, Cebadores)
Dos oligonucleótidos que
son,
cada
uno,
complementarios a una de
las dos hebras del ADN.
Únicos: Asegura alta especificidad:
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
CARACTERÍSTICAS
IMPORTANTES
Únicos
Tamaño
Dimeros de primers
5’
La secuencia del extremo 3’ es critica para el
funcionamiento
Tamaño
• Efectos en:
– Carácter de único
• Mas tamaño (15pb)
• Temperaturas de anillaje (ºTm)
– La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son
doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)
OJO con los dimeros de primers
Etapas de la PCR
Temperatura
1. Denaturación: Apertura de la doble cadena
2. Alineamiento: Anillaje de primers
3. Extensión: Generación de la nueva cadena
100
Denaturación
30 ciclos
94 oC
Extension
72 oC
50
50-60oC
Anillaje
0
Tiempo
Denaturación
94 oC
Animación Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
El numero de copias del DNA delimitado por
los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias
1
2
4
8
16
0
1
2
3
4
32
Numero de ciclos
5
64
6
Electroforesis
Revelado
Separación de moléculas en un campo eléctrico
Electrodo (+)
Cámara de electroforesis
Camas para preparación del gel
de agarosa
Fuente de poder
Electrodo (-)
Agarosa y su preparación
Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en
función del peso molecular
Agarosa
Mezclar agarosa con una solución
tampón como el TBE (tris-ac.
Borico-EDTA)
Calentar
Tinción con Bromuro de etidio
Agente intercalante Bromuro
de Etidio
Molécula fluorescente que se
intercala entre la s bases de la
molécula de DNA
Absorción a 330 nm
(UV)emisión en luz visible
Factores que afectan la velocidad de migración
1. TAMAÑO DEL FRAGMENTO
la velocidad de migración del fragmento es
inversamente proporcional al log del nº de
pares de bases
2. CONFORMACION DE LA
MOLECULA
ADN circular
ADN Lineal
3. VOLTAJE APLICADO
La velocidad de migración es
proporcional al voltaje aplicado
4. CONCENTRACIÓN
AGAROSA
Inversamente proporcional a
velocidad de corrido
2% 1.5%
1% 0.5%
Interpretación de electroforesis
Marcador de peso molecular
1.Permite identificar tamaño de fragmentos
25pb
50pb
100pb
Ejemplos de corridos de electroforesis
Con marcador de 100pb
Con marcador de 50pb
M
1
2
3
4
5
6
M
1
2
3
4
7
300pb 400pb
250pb
150pb
100pb
400pb
350pb 300pb
250pb
M
Bandas Inespecíficas
Corrido de electroforesis con bandas
inespecíficas
Bandas definidas con diferentes
pesos moleculares
Interpretación de electroforesis
Calidad del ADN
BUENA CALIDAD DE ADN
1
2
3
4
5
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
1-6: Pacientes
6
CP CN
DIFERENTES CALIDADES DE ADN
1
2
3
4
CP
CN
CP: Control Positivo
CN: Control Negativo
Pozo 2  No ADN
Pozos 3 y 4  Bajas concentraciones
Técnicas derivadas/ basadas en PCR
PCR Nested
:Amplificación de una secuencia dentro
de otro previamente amplificada
PCR Multiplex
:Varios targets diferentes en forma
simultánea
PCR-RFLP
:Polimorfismo genético
RT-PCR
: Detección de mRNA
Real Time PCR
:Cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
PCR Nested (anidada)
Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers
1 Reacción
Primers externos
para amplificación
de una secuencia
extensa
2 Reacción
Primers internos
para amplificación
de una región
especifica
SEGUNDA PCR
Genera mayor ESPECIFICIDAD
PCR Multiplex
• Amplificación de varias
secuencias de forma
simultanea
• Diferentes set de primers
• Ojo Tamaño del
amplicon
APLICACIONES
Ensayos de deleciones
Amplifica exones
Ensayos forenses
Biomarcadores polimórficos
Ensayos microbiológicos
Cepas y especies
RFLPs
Restriction fragment length polymorphism
• Estudios de polimorfismos:
variación en la secuencia de
ADN
METODOLOGIA
1. Extracción de ADN
2. PCR – se obtiene la
secuencia target
3. Digestión con enzimas de
restricción  mecanismo de
defensa de bacterias
4. Electroforesis en gel
Cambios en el sitio de restricción
Person A
5' GGCC
GGCC
GGCC
GGCC
3'
GGCC
GGTC
GGCC
3'
Person B
5' GGCC
Cambios en el sitio de restricción
Hae III corta:
5' GGCC
CC
5’ GGCC 3’
GGCC
GGCC
GG
CC
CC
3'
GG
CC
5' GGCC
GGCC
GGCC
GGTC
GG
GGCC
GG
CC
GG
3'
ADN NORMAL
A
B
ADN
ADN
NORMAL
SILVESTRE
C
B+C
A
B
C
C
ADN MUTADO
B
A
A
B+C
A
PCR en tiempo real (RT-PCR)
 La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la detección de
los productos en un solo tubo.
 “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van
generando
 Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo
real utilizando tecnologías fluorescentes
UTILIDADES
- Genotipificación
- Cuantificación de carga viral
- Cuantificación del numero de copias
de un gen
- Expresión génica (RNA) 
Retrotranscripción
Componentes RT-PCR
Target
DNA Polimerasa
Primer
Nucleótidos
Solución Buffer
Sonda
Termociclador
Segmento de ADN que se ha seleccionado para
amplificar. Es el molde (Muestra).
Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde
una hebra simple de ADN (produce una hebra
complementaria).
Segmentos cortos de ADN de cadena simple
específico para un segmento de DNA. Los primers
son usados como punto inicial de la actividad de la
DNA polimerasa.
Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto
biológico (A, T, C, G).
Solución que reúne las condiciones necesarias para
que la reacción de amplificación se de.
Segmento corto de ADN complementario al target
(marcadores fluorescentes)
Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de
detectar sondas)
PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real
PCR
tradicional
Preparación de la
Muestra
Amplificación
Detección
PCR en
Tiempo Real
Preparación de la
Muestra
Amplificación y Detección
Sistemas de Detección
Uso de moléculas fluorescentes
No-Específico
SYBR Green I
 Molecular fluorescente que se unen
a ADN
 Emisión a 520nm
DESVENTAJAS
Inespecífico
Curva de Melting
PRODUCTOS ESPECIFICOS
Curva de melting
PRODUCTOS ESPECÍFICOS TIENE UN MAYOR °TM
Sistema de Detección Específico
TaqMan
Uso de “secuencia especifica
de oligonucleotidos”
- Reportero 5’: Emite
fluorescencia
- Quencher 3’: Bloquea emisión
de fluorescencia
Actividad 5’ nucleasa
Separación reportero-quencher
Sistema de Detección Específico
Molecular Beacon Probes
Secuencia de la
sonda
Stem
Quencher
Fluoroforo
Molecular Beacon Probes
Sistema de Detección Específico
Scorpions probe
1. Hibridación del primer a una
secuencia target
Loop
Stem
Bloqueador
Quencher
Primer
Fluoroforo
2. Extensión de la
polimerasa formando un
producto de PCR
4. Fase de anillaje  Cambio conformacional
del loop
5. Hibridación
Cinética de
la PCR
 Exponencial: Duplicación
exacta del producto  se
acumula en cada ciclo.
 Lineal: Componentes
consumidos, productos
empiezan a degradarse.
 Plateau: Reacción se
consume y no se generan
más productos.
Fluorescencia
Plateau
Fase
logarítmica
UMBRAL
CT (CP)
Número de ciclos
• Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR
Green y Sondas de Hibridación (determinado automáticamente
por el instrumento).
• CT (CP): Número de ciclo en donde la fluorescencia supera el
umbral.
…El CT depende de la concentración inicial de ADN!
A > CT < [ ADN inicial ]
A < CT > [ ADN inicial ]
1
1.
2.
3.
4.
5.
10 ng = CT 18
1 ng = CT 21
100 pg = CT 25
10 pg = CT 28
Blanco
2
3
4
5
RT-PCR (Retro-transcripción)
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
mRNA
Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa
Primers: - Hexameros al azar
- Oligo dT
cDNA
PCR
Enzima Taq polimerasa
SECUENCIACIÓN
Mezcla de reacción
Secuenciación de Sanger
• Reacción de PCR
• Uso de:
– Dideoxinucleotidos
– Deoxinucleotidos  dNTPs
La Reacción con ddATP
3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTACCATGA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTACCATGA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
8pb
11pb
14pb
17pb
19pb
25pb
Separación de Fragmentos
ddCTP
ddGTP
ddTTP
Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope
ddATP
INTERPRETACION
DEL GEL
AGTACTTATGCAGGTC
ACGTGCA
Secuenciación automatizada
“Dye terminator”
 Marca fluorescente en cada uno de los diferentes
nucleótidos: A, T, G y C.
 Emisión de luz a una longitud de onda especifica 
Laser de iones de argón
Electroforesis
Capilar
Lecturas automatizadas de las
secuencias de ADN
Cromatograma o electrofenograma
- Se representa la base según color diferente
- Intensidad de la señal luminosa (altura del pico)
Secuenciación de Sanger
CITOGENETICA
Citogenética
Área de la Genética que estudia todo comportamiento celular, basado en el
análisis de la estructura y función de los cromosomas y el núcleo interfásico,
encaminado a establecer sus asociaciones con el desarrollo orgánico, físico y
poblacional de los organismos.
Convencional
Molecular
Citogenética convencional
Estructura, alteraciones cromosómicas
46, XY
Cariotipo
¿Que tipo de alteraciones se pueden estudiar?
•
•
•
•
Translocaciones
Inversiones
Deleciones
amplificaciones
Estructurales
• Monosomías
• trisomías
Numéricas
Estructurales
Translocaciones
Estructurales
Deleciones
Estructurales
Inversiones
Citogenética molecular
FISH
SONDA
FLUORESCENTE
SECUENCIA
COMPLEMENTARIA
Detección de
anomalías no
detectables por
técnicas de
citogenética de
rutina
Hibridación in situ fluorescente FISH
TIPOS DE SONDAS
Locus-especificas
 Secuencia especifica del ADN  LOCUS DETERMINADO
 Reordenamiento estructurales
 Anormalidades estructurales
1p19q
Sondas locus especificas
1p: Sonda verde, 19q: Sonda roja
NEUROCITOMA CON COMPLEMENTO NORMAL OLIGODENDROGLIOMA: CO-DELECIÓN 1P19Q
TIPOS DE SONDAS
Centromericas (CEP)
 Reconoce 2 - 3% secuencias centromericas.
 Detección de cromosomas concretos
 Anormalidades numéricas
PTEN EN CA PROSTATA
Sondas centromericas + Locus especificas
Cromosoma 10: Sonda verde, PTEN: Sonda roja
NORMAL
CARCINOMA
TIPOS DE SONDAS
De tinción cromosómico
 Detección de cromosomas concretos
 Anormalidades numéricas
Conclusiones
• Aunque en biología molecular existen muchas
técnicas para detección de cambios tanto a nivel
del ADN como a nivel cromosómico, el secreto esta
en seleccionar la mas adecuada dependiendo de
los requerimientos y la disponibilidad