Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR 2011-12 Inmaculada Martín Burriel [email protected] Curso PCR 2011-2012
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Otras PCR: PCR en tiempo
real (cuantitativa)
Curso PCR
2011-12
Inmaculada Martín Burriel
[email protected]
Curso PCR 2011-2012
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Programa:
• Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados:
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie
– Protocolo experimental (15 h) Aula Grados
• Diseño de primers y sonda (Primer express).
• Validación de primers.
• Optimización de la reacción:
– Matriz de primers
– Matriz de sonda
• Curva standard.
– Normalización de datos de expresión
Curso PCR 2011-2012
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Programa:
• Jueves 19 de enero (10h) LAGENBIO:
– Práctica: Realización de una PCR en
tiempo real.
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real :
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en
scrapie
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PCR clásico
• La cantidad de producto
no está relacionada con
la cantidad de DNA inicial
• Herramienta cualitativa
(presencia o ausencia)
• El bromuro de etidio es
poco sensible, cuando se
detecta ya se ha
sobrepasado la fase
exponencial
Curso PCR 2011-2012
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Técnicas de cuantificación
• Northern Blot
Curso PCR 2011-2012
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PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Early expression of p53 responsive genes (24h)
Bax
CD95/Fas
GAPDH
L
C
6
8
10
12
M
Curso PCR 2011-2012
Martín-Burriel et al. (2004)
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PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers
Bcl-2
Tgf-b1
c-myc
L
C
6
8
10
12
Curso PCR 2011-2012
M
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PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Curso PCR 2011-2012
Martín-Burriel et al. (2004) Toxicol Pathol
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Necesidad de PCR en tiempo real
• Necesidad de cuantificar diferencias de
expresión de un mRNA
• Disponibilidad de muy pequeñas
cantidades de mRNA en algunas prácticas
laboratoriales:
– Células obtenidas de microdisección por láser
– Pequeñas cantidades de tejido
– Biopsias embrionarias
– Especimenes de gran valor
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PCR en Tiempo Real
Nuevos químicos
Nuevas plataformas
instrumentales
Detección de productos
PCR en tiempo real
Permite observar la cinética
de la reacción
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Fases de la PCR
• Exponencial: En cada ciclo se dobla el
producto.
• Lineal: enlentecimiento, consumo de
componentes, principio de degradación.
• Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de
componentes, degradación de productos.
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Fases de la PCR
Logarítmica
Lineal
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Detección en la fase exponencial
Curso PCR 2011-2012
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Detección en la fase de meseta
Problemas de cuantificación
en la fase de meseta
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PCR en Tiempo Real
• Toma los datos mientras se producen.
• Cuantificación más exacta sin necesidad
de métodos laboriosos.
• Existe una relación cuantitativa entre la
cantidad inicial y la cantidad de producto
PCR en un ciclo dado.
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Flurocromos: SYBR Green
• Se intercala en el
surco menor del ADN
de doble cadena y
emite fluorescencia.
• No es equimolecular.
• Necesaria curva de
disociación.
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Curva de disociación
Tª Melting:
- Composición de bases del
fragmento
- Tamaño del fragmento.
-Tm dimeros < Tm fragmento
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Curva de disociación
Curso PCR 2011-2012
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Curva de disociación
Muestras problema
Controles negativos y sin RT
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Ventajas e inconvenientes
• PCR con SYBR Green:
– Más barato
– Los mismos reactivos sirven para analizar
cualquier fragmento
– La especificidad viene dada únicamente por
los primers
– No es equimolecular
– Se necesita realizar una curva de disociación
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Sondas TaqMan
•
•
•
•
•
Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa.
Reporter: FAM, VIC.
Quencher: TAMRA.
Importante tªm (~70ºC).
Equimolecular.
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Especificidad
Diseño de sondas entre dos exones
Curso PCR 2011-2012
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Equimolaridad
SYBR Green
TaqMan
Curso PCR 2011-2012
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Sondas MGB
R
• NFQ:
Quencher oscuro, no
emite fluorescencia.
MGB
Disminuye Baseline.
NFQ
Aumenta sensibilidad.
• MGB:
Se une al surco pequeño.
Aumenta la Tªm.
Aumenta la eficiencia.
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Ventajas e inconvenientes
• PCR con Sondas TaqMan:
– Más caro
– Utilización de sondas específicas para cada
fragmento a analizar
– La especificidad viene dada por los primers y
la sonda
– Es equimolecular
– No necesita curva de disociación
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Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
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Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
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Glosario de términos
• Cuantificación:
– Absoluta:
• Resultado final con unidades (carga viral, copias
de mensajero, copias de un gen,...).
• Se necesita una curva patrón absoluta.
– Relativa:
• Resultado sin unidades. Proporciona un
porcentaje de incremento o disminución
(expresión génica).
• Se necesita curva patrón (al menos para prueba
de primers).
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Glosario de términos
• Referencia:
– Señal utilizada para normalizar el experimento.
• Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).
• Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción).
• Calibrador:
– Muestra que usamos para comparar las demás.
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Glosario de términos
• Standard (patrón):
– Muestra de concentración conocida que
nos permite construir la curva de
calibrado.
• Threshold (umbral):
– Ct es el ciclo en el cual se detecta un
incremento significativo de DRn
(fluorescencia). El sistema empieza a
detectar la señal asociada al incremento
exponencial de producto PCR (Fase
exponencial)
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Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
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Métodos de cuantificación
• Curva estándar
• Delta Ct
• Método de Pfaffl
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Curva estándar
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Curva estándar
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Curva Patrón
•
•
•
•
y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA].
Relaciona cada concentración con su Ct.
Propia de cada pareja de primers.
La pendiente depende de la eficiencia de los
primers y no debería cambiar entre
experimentos:
–
–
–
–
100% (a=-3.32).
75% (a=-4).
Aceptable:-3 ≤ -4.
a> -3 contaminación por fluorescencia.
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Curva Patrón
• Correlación (R2):
–
–
–
–
R2=1 (perfecta).
R2≥0.97 (0.99).
Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima.
Mantener el umbral entre experimentos.
• Nº de réplicas:
– Al menos 2 réplicas por muestra.
– Desviación estándar ≤ 0.38
• Muestra:
– Curva absoluta: muestra de [] conocida.
– Diluciones 1/5.
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1. Cuantificación Absoluta
• Validación de la curva patrón:
– La precisión de la cuantificación dependerá de la
precisión de los patrones.
– Patrones:
•
•
•
•
DNA plasmídico.
DNA genómico.
Productos PCR.
Grandes oligonucleótidos comerciales.
– Resultado final relativo a una unidad de interés:
•
•
•
•
Copias/ng de RNA
Copias/g tejido, copias/ml sangre.
Copias/genoma.
Copias/ célula.
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ATENCION
DENOMINADOR
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1. Cuantificación Absoluta
• Posibles curvas de calibrado (Expresión
génica):
– Productos de RT-PCR u oligonucleótidos:
• Rápido, conocimiento preciso de [DNA].
• Inestable, problemas en la reamplificación.
– DNA recombinante:
• Muy estable, sin problemas de amplificación, talla
similar a transcritos.
• Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la
eficacia de la RT.
– RNA recombinante:
• Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir
RNA background).
• Muy inestable, clonación complicado, purificación,
problemas de almacenamiento.
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1. Cuantificación Absoluta
• Puntos críticos de la curva patrón:
– DNA o RNA puro y muy concentrado.
– Exactitud en la medida de la concentración
inicial (7 veces).
– Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA
original hasta concentraciones similares a las
muestras biológicas (106-1012).
– Estabilidad de las muestras patrón (RNA).
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2. Cuantificación Relativa
• Curva patrón:
– Sencillez en la preparación.
– La cantidad de producto (n veces) se refiere a
la obtenida en el calibrador (1x).
– No hay unidades.
– Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para
la obtención.
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2. Cuantificación Relativa
• Puntos críticos de la curva patrón:
– Dilución adecuada del RNA o DNA patrón.
– La utilización de las mismas muestras en
placas distintas permite comparar resultados.
– Se pueden utilizar patrones DNA para análisis
de RNA.
– Se necesitan curvas patrón para el gen de
estudio y el control endógeno.
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Slide 42
Cuantificación de la expresión
génica
Referencia activa:
Muestra 1
Muestra 2
Gen problema
4
8
Control endógeno
2
16
ratio
2
0.5
Control de la eficiencia de la Retro-transcripción.
Control de la eficiencia de la extracción de RNA.
Buscar referencias bibliográficas.
Utilizar tres endógenos.
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Slide 43
Análisis de expresión CON curva
patrón
Gen Referencia: GAPDH
Gen Estudio: SPP1
21.58
27.68
27.36
16.62
T0
T7
-1.92
-0.42
-0.3 -0.2
0.0121
0.38 Cantidad
0.49 0.627 Cantidad
0.49/0.0121
0.627/0.38
relativa
relativa
= 24.54
Qgen trat/Q norm trat
Q gen
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Ctrl/Q norm Ctrl
=Fold Change
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Cuantificación Relativa
La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados.
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Slide 45
Método de Pfaffl (2001)
Eficiencia: pendiente de la curva
patrón
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http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/dnaveff.jpg
Slide 46
Método de Pfaffl (2001)
• eficiencia =10-1/pendiente
• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/3.32=2
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Slide 47
Análisis de expresión SIN curva
patrón
• Método de comparación de Ct= 2-DDCt
DDCt= DCt , muestra-DCt, calibrador
DCt , muestra: Valor de Ct para una muestra
normalizado con el del control endógeno.
DCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador
normalizado con el del control endógeno.
Expresión gen/ Expresión basal del gen
=2-DDCt
Expresión endógeno/ Expresión basal endóg
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Análisis de expresión SIN curva
patrón
• Método de comparación de Ct
• Se basa en la eficiencia de los primers
• Se refiere a la muestra con mayor cantidad de
gen de estudio (o menor Ct)
• Q = e(menor Ct- Ct muestra)
• e =10-1/pendiente
• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2
Ejemplo
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Slide 49
2. Cuantificación Relativa
• PCR Múltiple:
– Amplificación del gen de interés y el
endógeno en el mismo tubo.
– Reporter: 6-FAM y JOE.
– Evitar competición en la reacción:
• Limitar la concentración de primers del gen más
abundante.
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Cuantificación Relativa
• Elección del método:
– Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos
distintos y usar curva patrón:
• Rápida optimización y validación.
– Utilización del método 2-DDCt :
•
•
•
•
Se necesitan eficiencias de amplificación similares.
No necesita curva patrón.
Elimina los errores de dilución de la curva patrón.
Preferible el método de Pfeffl una vez calculada la eficiencia
– PCR Múltiple:
• Más puesta a punto.
• Mayor rapidez de análisis.
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Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
Slide 52
Polimorfismo de SNPs
• Sondas alelo-específicas.
• Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor
discriminación.
• Utilización de oligos alelo-específicos y
SYBR Green.
• Las curvas de disociación discriminan
alelos.
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Metodología
ryr-1:
CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG
Forward
Sonda 12
Reverse
CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC
GC TCC AAC
FAM
VIC
Protocolo:
Componentes de la reacción
Volumen /
Reacción
(ml)
Final concentración
TaqMan® Universal PCR
Master Mix, No AmpErase®
UNG (2X)
12,5
1X
40X Assay Mix
(Mescla de cebadores y
sondas)
0,625
1X
DNA
2
H2O
9,875
Curso PCR1-20
2011-2012
ng
---
Pre-lectura:
60ºC
PCR:
95ºC
92ºC
60ºC
Post-lectura:
60ºC
1min
10min
15sec
(x50)
1min
1min
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Resultados
CT
CC
TT
NTC
Curso PCR 2011-2012
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Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +/-
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Ensayos +/• Se marca el ensayo con sonda TaqMan o
SYBRGreen.
• Adición de un control interno positivo
(control de amplificación).
Eliminar Falsos Negativos
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Programa:
• Viernes 14 de enero (9:30 h) Aula Máster:
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en
scrapie
Curso PCR 2011-2012
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Programa:
• Miércoles 20 de enero
Aula Máster :
– Práctica: Realización de una PCR en
tiempo real.
– Protocolo experimental:
• Diseño de primers y sonda (Primer express).
• Validación de primers.
• Optimización de la reacción:
– Matriz de primers
– Matriz de sonda
• Curva standard.
– Normalización de datos de expresión
– Ejemplo: estabilidad de HKG en scrapie.
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Slide 59
Diseño primers
•
•
•
•
Tamaño amplicon: 50-150pb
%GC: 20-80%
Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’
Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se
recomiendan longitudes <18pb)
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Diseño de primers y sonda (Primer express).
Curso PCR 2011-2012
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Diseño de primers
• Tm: 58-60ºC
– Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está
unida y el 50% despegada
– Si se pega más del 50%más posibilidad de
inespecificidades
– En tiempo real: Tª=Tm
• Diferencia de Tm entre los dos primers <
2ºC
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Diseño de primers
Primer F: Tm 58ºC
Primer R: Tm 60ºC
PCR: 60ºC
[Primer F]
Curso PCR 2011-2012
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Matriz de Primers
Primer Forward
Primer Reverse
50nM 300nM 900nM
50nM
2X
2X
2X
300nM
2X
2X
2X
900nM
2X
2X
2X
Curso PCR 2011-2012
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Matriz de primers
< Ct > Sensibilidad
> Rn primers no limitantes
Curso PCR 2011-2012
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Diseño de sondas
• Tm sonda 10ºC > Tm primers
• Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente
antes de la mayor eficiencia de la polimerasa
• GC: 20-80%
• Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB)
• Nunca puede haber G en el extremo 5’
(quencher natural)
• <4G continuas
• Procurar [C]>[G]
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Matriz de sonda
• Se realiza tras la optimización de los
primers (para ello sonda a 250nM)
• Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a
225nM
Componentes de la reacción
Volumen / Reacción
(ml)
Final concentración
12,5
1X
Forward
1
900/300/50 nM
Reverse
1
900/300/50 nM
Sonda
1,25
250 nM
H2O
8,25
---
DNA
1
50 ng
Total
25
TaqMan® Universal PCR
Master Mix, No AmpErase®
UNG (2X)
Curso PCR 2011-2012
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Matriz de sonda
250 nM
200 nM
150 nM
100 nM
50 nM
Curso PCR 2011-2012
< Ct > Sensibilidad
> Rn no limitante
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Recta patrón Gen Referencia
Nos muestra la eficiencia de los
primers:
Curso PCR 2011-2012
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Recta Patrón: Gen de estudio
Curso PCR 2011-2012
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Curso PCR 2011-2012
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Control de la curva patrón
• Seleccionar el umbral (manualmente) para
obtener la mayor correlación (>0.99)
• Asegurarnos de que las curvas de melting
son adecuadas
• Confirmar que las pendientes de las
muestras son iguales en vista logarítmica
• Eliminar muestras de las diluciones que se
entrecrucen
• Eliminar muestras que se amplifican a Ct<10
• La curva debe tener 5 o + puntos
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Etapas del análisis de expresión
• Extracción de RNA
• Retrotranscripción
• Análisis de la expresión del gen (genes)
de referencia
• Análisis de la expresión del gen de estudio
• Normalización
• Análisis de los resultados
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Retrotranscripción
• El paso más delicado por la baja eficiencia de la
enzima
• Distintas retrotranscriptasas en función del
experimento:
– Expresión génica (MLMv o modificaciones)
– rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA
difíciles)
• Primers:
– Random Hexamers expresión
– Poly(dT)
– Específico (la eficiencia de la RT dependerá del
primer) virus
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Errores más comunes
1. Mal diseño de primers y sondas:
– Utilizar software:
•
•
•
•
Obtener la Tm óptima,
Evitar complementariedad entre primers,
Observar estructura secundaria
Atención al tamañio del amplicón
– Elegir primers en la unión de exones
– Eficiencia pobre
2. Pobre calidad del RNA:
– Los amplicones cortos (70-250bp) toleran cierta
degradación
– Para una buena cuantificación, evitar la degradación
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Errores más comunes
3. No utilizar master-mix:
– Los errores de pipeteo se amplifican
– Minimiza la variación entre muestres y
réplicas
– Rox en master-mix.
4. Contaminación:
– Utilizar siempre un NTC
5. No utilizar un “–RT” control
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Errores más comunes
6.
Usar un control de normalización inadecuado:
–
–
7.
No hacer curvas de disociación con SYBR-Green:
–
Podemos “cuantificar dímeros” o bandas contaminantes
No elegir adecuadamente “baseline” y “threshold”
8.
•
•
9.
Elegir controles estables
¿Existen referencias bibliográficas en nuestro modelo?
Baseline: 2 ciclos antes que el Ct de la muestra más
abundante
Threshold: en fase exponencia (al menos a 10 desviaciones
estándar del inicio de baseline
Utilizar curvas estándar de rango inapropiado
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Otras PCR: PCR en tiempo
real (cuantitativa)
Curso PCR
2011-12
Inmaculada Martín Burriel
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Programa:
• Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados:
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie
– Protocolo experimental (15 h) Aula Grados
• Diseño de primers y sonda (Primer express).
• Validación de primers.
• Optimización de la reacción:
– Matriz de primers
– Matriz de sonda
• Curva standard.
– Normalización de datos de expresión
Curso PCR 2011-2012
Slide 3
Programa:
• Jueves 19 de enero (10h) LAGENBIO:
– Práctica: Realización de una PCR en
tiempo real.
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real :
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en
scrapie
Curso PCR 2011-2012
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PCR clásico
• La cantidad de producto
no está relacionada con
la cantidad de DNA inicial
• Herramienta cualitativa
(presencia o ausencia)
• El bromuro de etidio es
poco sensible, cuando se
detecta ya se ha
sobrepasado la fase
exponencial
Curso PCR 2011-2012
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Técnicas de cuantificación
• Northern Blot
Curso PCR 2011-2012
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PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Early expression of p53 responsive genes (24h)
Bax
CD95/Fas
GAPDH
L
C
6
8
10
12
M
Curso PCR 2011-2012
Martín-Burriel et al. (2004)
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PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers
Bcl-2
Tgf-b1
c-myc
L
C
6
8
10
12
Curso PCR 2011-2012
M
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PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Curso PCR 2011-2012
Martín-Burriel et al. (2004) Toxicol Pathol
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Necesidad de PCR en tiempo real
• Necesidad de cuantificar diferencias de
expresión de un mRNA
• Disponibilidad de muy pequeñas
cantidades de mRNA en algunas prácticas
laboratoriales:
– Células obtenidas de microdisección por láser
– Pequeñas cantidades de tejido
– Biopsias embrionarias
– Especimenes de gran valor
Curso PCR 2011-2012
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PCR en Tiempo Real
Nuevos químicos
Nuevas plataformas
instrumentales
Detección de productos
PCR en tiempo real
Permite observar la cinética
de la reacción
Curso PCR 2011-2012
Slide 11
Fases de la PCR
• Exponencial: En cada ciclo se dobla el
producto.
• Lineal: enlentecimiento, consumo de
componentes, principio de degradación.
• Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de
componentes, degradación de productos.
Curso PCR 2011-2012
Slide 12
Fases de la PCR
Logarítmica
Lineal
Curso PCR 2011-2012
Slide 13
Detección en la fase exponencial
Curso PCR 2011-2012
Slide 14
Detección en la fase de meseta
Problemas de cuantificación
en la fase de meseta
Curso PCR 2011-2012
Slide 15
PCR en Tiempo Real
• Toma los datos mientras se producen.
• Cuantificación más exacta sin necesidad
de métodos laboriosos.
• Existe una relación cuantitativa entre la
cantidad inicial y la cantidad de producto
PCR en un ciclo dado.
Curso PCR 2011-2012
Slide 16
Flurocromos: SYBR Green
• Se intercala en el
surco menor del ADN
de doble cadena y
emite fluorescencia.
• No es equimolecular.
• Necesaria curva de
disociación.
Curso PCR 2011-2012
Slide 17
Curva de disociación
Tª Melting:
- Composición de bases del
fragmento
- Tamaño del fragmento.
-Tm dimeros < Tm fragmento
Curso PCR 2011-2012
Slide 18
Curva de disociación
Curso PCR 2011-2012
Slide 19
Curva de disociación
Muestras problema
Controles negativos y sin RT
Curso PCR 2011-2012
Slide 20
Ventajas e inconvenientes
• PCR con SYBR Green:
– Más barato
– Los mismos reactivos sirven para analizar
cualquier fragmento
– La especificidad viene dada únicamente por
los primers
– No es equimolecular
– Se necesita realizar una curva de disociación
Curso PCR 2011-2012
Slide 21
Sondas TaqMan
•
•
•
•
•
Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa.
Reporter: FAM, VIC.
Quencher: TAMRA.
Importante tªm (~70ºC).
Equimolecular.
Curso PCR 2011-2012
Slide 22
Especificidad
Diseño de sondas entre dos exones
Curso PCR 2011-2012
Slide 23
Equimolaridad
SYBR Green
TaqMan
Curso PCR 2011-2012
Slide 24
Sondas MGB
R
• NFQ:
Quencher oscuro, no
emite fluorescencia.
MGB
Disminuye Baseline.
NFQ
Aumenta sensibilidad.
• MGB:
Se une al surco pequeño.
Aumenta la Tªm.
Aumenta la eficiencia.
Curso PCR 2011-2012
Slide 25
Ventajas e inconvenientes
• PCR con Sondas TaqMan:
– Más caro
– Utilización de sondas específicas para cada
fragmento a analizar
– La especificidad viene dada por los primers y
la sonda
– Es equimolecular
– No necesita curva de disociación
Curso PCR 2011-2012
Slide 26
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
Slide 27
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
Slide 28
Glosario de términos
• Cuantificación:
– Absoluta:
• Resultado final con unidades (carga viral, copias
de mensajero, copias de un gen,...).
• Se necesita una curva patrón absoluta.
– Relativa:
• Resultado sin unidades. Proporciona un
porcentaje de incremento o disminución
(expresión génica).
• Se necesita curva patrón (al menos para prueba
de primers).
Curso PCR 2011-2012
Slide 29
Glosario de términos
• Referencia:
– Señal utilizada para normalizar el experimento.
• Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).
• Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción).
• Calibrador:
– Muestra que usamos para comparar las demás.
Curso PCR 2011-2012
Slide 30
Glosario de términos
• Standard (patrón):
– Muestra de concentración conocida que
nos permite construir la curva de
calibrado.
• Threshold (umbral):
– Ct es el ciclo en el cual se detecta un
incremento significativo de DRn
(fluorescencia). El sistema empieza a
detectar la señal asociada al incremento
exponencial de producto PCR (Fase
exponencial)
Curso PCR 2011-2012
Slide 31
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
Slide 32
Métodos de cuantificación
• Curva estándar
• Delta Ct
• Método de Pfaffl
Curso PCR 2011-2012
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Curva estándar
Curso PCR 2011-2012
Slide 34
Curva estándar
Curso PCR 2011-2012
Slide 35
Curva Patrón
•
•
•
•
y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA].
Relaciona cada concentración con su Ct.
Propia de cada pareja de primers.
La pendiente depende de la eficiencia de los
primers y no debería cambiar entre
experimentos:
–
–
–
–
100% (a=-3.32).
75% (a=-4).
Aceptable:-3 ≤ -4.
a> -3 contaminación por fluorescencia.
Curso PCR 2011-2012
Slide 36
Curva Patrón
• Correlación (R2):
–
–
–
–
R2=1 (perfecta).
R2≥0.97 (0.99).
Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima.
Mantener el umbral entre experimentos.
• Nº de réplicas:
– Al menos 2 réplicas por muestra.
– Desviación estándar ≤ 0.38
• Muestra:
– Curva absoluta: muestra de [] conocida.
– Diluciones 1/5.
Curso PCR 2011-2012
Slide 37
1. Cuantificación Absoluta
• Validación de la curva patrón:
– La precisión de la cuantificación dependerá de la
precisión de los patrones.
– Patrones:
•
•
•
•
DNA plasmídico.
DNA genómico.
Productos PCR.
Grandes oligonucleótidos comerciales.
– Resultado final relativo a una unidad de interés:
•
•
•
•
Copias/ng de RNA
Copias/g tejido, copias/ml sangre.
Copias/genoma.
Copias/ célula.
Curso PCR 2011-2012
ATENCION
DENOMINADOR
Slide 38
1. Cuantificación Absoluta
• Posibles curvas de calibrado (Expresión
génica):
– Productos de RT-PCR u oligonucleótidos:
• Rápido, conocimiento preciso de [DNA].
• Inestable, problemas en la reamplificación.
– DNA recombinante:
• Muy estable, sin problemas de amplificación, talla
similar a transcritos.
• Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la
eficacia de la RT.
– RNA recombinante:
• Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir
RNA background).
• Muy inestable, clonación complicado, purificación,
problemas de almacenamiento.
Curso PCR 2011-2012
Slide 39
1. Cuantificación Absoluta
• Puntos críticos de la curva patrón:
– DNA o RNA puro y muy concentrado.
– Exactitud en la medida de la concentración
inicial (7 veces).
– Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA
original hasta concentraciones similares a las
muestras biológicas (106-1012).
– Estabilidad de las muestras patrón (RNA).
Curso PCR 2011-2012
Slide 40
2. Cuantificación Relativa
• Curva patrón:
– Sencillez en la preparación.
– La cantidad de producto (n veces) se refiere a
la obtenida en el calibrador (1x).
– No hay unidades.
– Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para
la obtención.
Curso PCR 2011-2012
Slide 41
2. Cuantificación Relativa
• Puntos críticos de la curva patrón:
– Dilución adecuada del RNA o DNA patrón.
– La utilización de las mismas muestras en
placas distintas permite comparar resultados.
– Se pueden utilizar patrones DNA para análisis
de RNA.
– Se necesitan curvas patrón para el gen de
estudio y el control endógeno.
Curso PCR 2011-2012
Slide 42
Cuantificación de la expresión
génica
Referencia activa:
Muestra 1
Muestra 2
Gen problema
4
8
Control endógeno
2
16
ratio
2
0.5
Control de la eficiencia de la Retro-transcripción.
Control de la eficiencia de la extracción de RNA.
Buscar referencias bibliográficas.
Utilizar tres endógenos.
Curso PCR 2011-2012
Slide 43
Análisis de expresión CON curva
patrón
Gen Referencia: GAPDH
Gen Estudio: SPP1
21.58
27.68
27.36
16.62
T0
T7
-1.92
-0.42
-0.3 -0.2
0.0121
0.38 Cantidad
0.49 0.627 Cantidad
0.49/0.0121
0.627/0.38
relativa
relativa
= 24.54
Qgen trat/Q norm trat
Q gen
Curso PCR 2011-2012
Ctrl/Q norm Ctrl
=Fold Change
Slide 44
Cuantificación Relativa
La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados.
Curso PCR 2011-2012
Slide 45
Método de Pfaffl (2001)
Eficiencia: pendiente de la curva
patrón
Curso PCR 2011-2012
http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/dnaveff.jpg
Slide 46
Método de Pfaffl (2001)
• eficiencia =10-1/pendiente
• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/3.32=2
Curso PCR 2011-2012
Slide 47
Análisis de expresión SIN curva
patrón
• Método de comparación de Ct= 2-DDCt
DDCt= DCt , muestra-DCt, calibrador
DCt , muestra: Valor de Ct para una muestra
normalizado con el del control endógeno.
DCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador
normalizado con el del control endógeno.
Expresión gen/ Expresión basal del gen
=2-DDCt
Expresión endógeno/ Expresión basal endóg
Curso PCR 2011-2012
Slide 48
Análisis de expresión SIN curva
patrón
• Método de comparación de Ct
• Se basa en la eficiencia de los primers
• Se refiere a la muestra con mayor cantidad de
gen de estudio (o menor Ct)
• Q = e(menor Ct- Ct muestra)
• e =10-1/pendiente
• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2
Ejemplo
Curso PCR 2011-2012
Slide 49
2. Cuantificación Relativa
• PCR Múltiple:
– Amplificación del gen de interés y el
endógeno en el mismo tubo.
– Reporter: 6-FAM y JOE.
– Evitar competición en la reacción:
• Limitar la concentración de primers del gen más
abundante.
Curso PCR 2011-2012
Slide 50
Cuantificación Relativa
• Elección del método:
– Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos
distintos y usar curva patrón:
• Rápida optimización y validación.
– Utilización del método 2-DDCt :
•
•
•
•
Se necesitan eficiencias de amplificación similares.
No necesita curva patrón.
Elimina los errores de dilución de la curva patrón.
Preferible el método de Pfeffl una vez calculada la eficiencia
– PCR Múltiple:
• Más puesta a punto.
• Mayor rapidez de análisis.
Curso PCR 2011-2012
Slide 51
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2011-2012
Slide 52
Polimorfismo de SNPs
• Sondas alelo-específicas.
• Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor
discriminación.
• Utilización de oligos alelo-específicos y
SYBR Green.
• Las curvas de disociación discriminan
alelos.
Curso PCR 2011-2012
Slide 53
Metodología
ryr-1:
CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG
Forward
Sonda 12
Reverse
CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC
GC TCC AAC
FAM
VIC
Protocolo:
Componentes de la reacción
Volumen /
Reacción
(ml)
Final concentración
TaqMan® Universal PCR
Master Mix, No AmpErase®
UNG (2X)
12,5
1X
40X Assay Mix
(Mescla de cebadores y
sondas)
0,625
1X
DNA
2
H2O
9,875
Curso PCR1-20
2011-2012
ng
---
Pre-lectura:
60ºC
PCR:
95ºC
92ºC
60ºC
Post-lectura:
60ºC
1min
10min
15sec
(x50)
1min
1min
Slide 54
Resultados
CT
CC
TT
NTC
Curso PCR 2011-2012
Slide 55
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +/-
Curso PCR 2011-2012
Slide 56
Ensayos +/• Se marca el ensayo con sonda TaqMan o
SYBRGreen.
• Adición de un control interno positivo
(control de amplificación).
Eliminar Falsos Negativos
Curso PCR 2011-2012
Slide 57
Programa:
• Viernes 14 de enero (9:30 h) Aula Máster:
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
• Ejemplo: Perfiles de expresión génica en
scrapie
Curso PCR 2011-2012
Slide 58
Programa:
• Miércoles 20 de enero
Aula Máster :
– Práctica: Realización de una PCR en
tiempo real.
– Protocolo experimental:
• Diseño de primers y sonda (Primer express).
• Validación de primers.
• Optimización de la reacción:
– Matriz de primers
– Matriz de sonda
• Curva standard.
– Normalización de datos de expresión
– Ejemplo: estabilidad de HKG en scrapie.
Curso PCR 2011-2012
Slide 59
Diseño primers
•
•
•
•
Tamaño amplicon: 50-150pb
%GC: 20-80%
Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’
Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se
recomiendan longitudes <18pb)
Curso PCR 2011-2012
Slide 60
Diseño de primers y sonda (Primer express).
Curso PCR 2011-2012
Slide 61
Diseño de primers
• Tm: 58-60ºC
– Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está
unida y el 50% despegada
– Si se pega más del 50%más posibilidad de
inespecificidades
– En tiempo real: Tª=Tm
• Diferencia de Tm entre los dos primers <
2ºC
Curso PCR 2011-2012
Slide 62
Diseño de primers
Primer F: Tm 58ºC
Primer R: Tm 60ºC
PCR: 60ºC
[Primer F]
Curso PCR 2011-2012
Slide 63
Matriz de Primers
Primer Forward
Primer Reverse
50nM 300nM 900nM
50nM
2X
2X
2X
300nM
2X
2X
2X
900nM
2X
2X
2X
Curso PCR 2011-2012
Slide 64
Matriz de primers
< Ct > Sensibilidad
> Rn primers no limitantes
Curso PCR 2011-2012
Slide 65
Diseño de sondas
• Tm sonda 10ºC > Tm primers
• Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente
antes de la mayor eficiencia de la polimerasa
• GC: 20-80%
• Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB)
• Nunca puede haber G en el extremo 5’
(quencher natural)
• <4G continuas
• Procurar [C]>[G]
Curso PCR 2011-2012
Slide 66
Matriz de sonda
• Se realiza tras la optimización de los
primers (para ello sonda a 250nM)
• Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a
225nM
Componentes de la reacción
Volumen / Reacción
(ml)
Final concentración
12,5
1X
Forward
1
900/300/50 nM
Reverse
1
900/300/50 nM
Sonda
1,25
250 nM
H2O
8,25
---
DNA
1
50 ng
Total
25
TaqMan® Universal PCR
Master Mix, No AmpErase®
UNG (2X)
Curso PCR 2011-2012
Slide 67
Matriz de sonda
250 nM
200 nM
150 nM
100 nM
50 nM
Curso PCR 2011-2012
< Ct > Sensibilidad
> Rn no limitante
Slide 68
Recta patrón Gen Referencia
Nos muestra la eficiencia de los
primers:
Curso PCR 2011-2012
Slide 69
Recta Patrón: Gen de estudio
Curso PCR 2011-2012
Slide 70
Curso PCR 2011-2012
Slide 71
Control de la curva patrón
• Seleccionar el umbral (manualmente) para
obtener la mayor correlación (>0.99)
• Asegurarnos de que las curvas de melting
son adecuadas
• Confirmar que las pendientes de las
muestras son iguales en vista logarítmica
• Eliminar muestras de las diluciones que se
entrecrucen
• Eliminar muestras que se amplifican a Ct<10
• La curva debe tener 5 o + puntos
Curso PCR 2011-2012
Slide 72
Etapas del análisis de expresión
• Extracción de RNA
• Retrotranscripción
• Análisis de la expresión del gen (genes)
de referencia
• Análisis de la expresión del gen de estudio
• Normalización
• Análisis de los resultados
Curso PCR 2011-2012
Slide 73
Retrotranscripción
• El paso más delicado por la baja eficiencia de la
enzima
• Distintas retrotranscriptasas en función del
experimento:
– Expresión génica (MLMv o modificaciones)
– rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA
difíciles)
• Primers:
– Random Hexamers expresión
– Poly(dT)
– Específico (la eficiencia de la RT dependerá del
primer) virus
Curso PCR 2011-2012
Slide 74
Errores más comunes
1. Mal diseño de primers y sondas:
– Utilizar software:
•
•
•
•
Obtener la Tm óptima,
Evitar complementariedad entre primers,
Observar estructura secundaria
Atención al tamañio del amplicón
– Elegir primers en la unión de exones
– Eficiencia pobre
2. Pobre calidad del RNA:
– Los amplicones cortos (70-250bp) toleran cierta
degradación
– Para una buena cuantificación, evitar la degradación
Curso PCR 2011-2012
Slide 75
Errores más comunes
3. No utilizar master-mix:
– Los errores de pipeteo se amplifican
– Minimiza la variación entre muestres y
réplicas
– Rox en master-mix.
4. Contaminación:
– Utilizar siempre un NTC
5. No utilizar un “–RT” control
Curso PCR 2011-2012
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Errores más comunes
6.
Usar un control de normalización inadecuado:
–
–
7.
No hacer curvas de disociación con SYBR-Green:
–
Podemos “cuantificar dímeros” o bandas contaminantes
No elegir adecuadamente “baseline” y “threshold”
8.
•
•
9.
Elegir controles estables
¿Existen referencias bibliográficas en nuestro modelo?
Baseline: 2 ciclos antes que el Ct de la muestra más
abundante
Threshold: en fase exponencia (al menos a 10 desviaciones
estándar del inicio de baseline
Utilizar curvas estándar de rango inapropiado
Curso PCR 2011-2012