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Aislamiento de ADN

Paula Bautista Bacterióloga

Métodos de aislamiento de ADN

 El aislamiento o extracción de ADN es el punto crucial en Biología Molecular.

 Es el primer paso para realizar cualquier técnica de biología molecular.

Extracción y Purificación

   

Extracción:

sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los restos celulares (

debris

).     

Purificación:

Separación de AN: De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos

El problema

Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de AN es necesario disponer de éstos en estado puro. Por qué purificar?

• Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los ácidos nucléicos.

• Interferentes que inhiben los procedimientos posteriores. • El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN • Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

Etapas básicas para Extracción y Purificación de AN Muestra Lisis celular Separación y purificación

Lugar de trabajo y material estéril, Además de guantes

Precipitación Cualitativo: electroforesis Calidad Cuantitativo: espectrofotometría UV

1. Métodos de lisis celular

El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).

• • • Métodos Físicos (Baño María, Congelación- Descongelación Sonicación…) Métodos Químicos (Detergentes) Métodos Enzimáticos (Proteinasa K)

2. Separación y Purificación

Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez mas limpio. • Desproteinización con fenol, que al denaturar proteínas causa su precipitación.

• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”) • Cromatografía  De adsorción a sílica  De filtración *** Lavados***

3. Precipitación

 Permite la obtención del ácido nucleíco listo para ser almacenado o diluido a la concentración deseada para su utilización.

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados

 Cantidad de material de partida  Número de copias de las moléculas de AN  Cantidad de tejido  Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado)  Contaminantes e interferentes en el material biológico

 En el pasado, el proceso de extracción y purificación de ácidos nucleícos solía ser complicado, laborioso y limitado en términos de rendimiento.

 Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser usados para extraer biomoléculas puras.

QIAGEN

  Es un técnica rápida y fácil para obtener ADN.

El ADN puede ser obtenido a partir de sangre, plasma, suero, capa de blancos, tejido, células bucales, otros fluidos biológicos, cultivos celulares.

QIAGEN

 El buffer de lisis es ajustado para permitir fijar el ADN a la membrana. El ADN es absorbido por la membrana de sílica gel durante la centrifugación.

 Las condiciones de pH en el lisado aseguran que las proteínas y otros contaminantes que puedan inhibir la PCR y otras reacciones enzimáticas, no sean retenidas en la membrana.

Adsorción de DNA a sílica

VENTAJAS

 Las muestras pueden estar en citrato, heparina o EDTA. No es necesaria una previa separación de leucocitos.

 El procedimiento de purificación se realiza usando las columnas y esto disminuye el grado de contaminación.

 Permite obtener un ADN libre de proteínas, nucleasas y otros contaminantes o inhibidores.

  Se obtiene buena concentración de ADN Las muestras pueden ser frescas o congeladas.

Procedimiento

Verificación Calidad ADN

Electroforesis en Gel de Agarosa

Gracias