Transcript 愛滋病病毒實驗室診斷 Laboratory Diagnostic on HIV infection : : 2006/12/03

愛滋病病毒實驗室診斷
Laboratory Diagnostic on HIV infection
講者 : 劉綺芬
部門 : 衛生局公共衛生化驗所
日期 : 2006/12/03
1
人類免疫缺乏病毒
Human Immnodeficiency Virus ; HIV
2
人類免疫缺乏病毒構造
(HIV Structure )
• 逆轉錄病毒科 (Retroviridae):反轉錄酵
素(reverse transcriptase)將RNA反轉錄成
DNA, 嵌入宿主之DNA
• 慢病毒屬 Lentivirinae
• 兩條單股RNA Two single strand RNA
• 圓球形Spherical
• 100~120nm
• 人類後天免疫缺乏症候群 Acquried
Immunodeficiency Syndrome ; AIDS
3
種系發生圖Phylogenetic tree
• Human immundeficiency Virus (HIV)
• Feline Immunodeficiency Virus (FIV)
• Simian Immunodeficiency Virus (SIV)
4
生活史Life Cycle
5
生活史Life Cycle
• 目標細胞 Target Cell :CD4+淋巴球細胞 CD4+T
cell、巨噬細胞 Macrophage 、單核細胞
Monocytes 、樹突細胞 Dendritic cell
•受體CCR5 (R5), CXCR4受體 (R4)
• 溶合Fusion
• 逆轉錄Reverse Transcription : RNA cDNA
• 整合Integration
• 轉錄 Transcription
• 轉譯 Translation
• 裝配 Synthesis of progeny virus
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• 出芽 Budding
HIV 基因結構 Genome
9 個基因 Gene
3 構造基因
structural genes
功能 Function
gag (group antigen)
(決定核心蛋白)
Pol (polymerase)
(
)
Env (envelope)
決定套膜上特異性蛋白
2 調節基因
regulatory gene
Tat (轉活)
rev(調節)
4 輔助基因
accessory gene
Vif(感染力因子)
nef(負因子)
vpu(祗存在 HIV-1)
vpr(祗存在 hiv-2)
vpx (祗存在 HIV-2)
P17(基質蛋白)
p24(核心蛋白), p7, p9
P55 precusor 前體
P66 及 p51 (
),
p9 protease(
),
p32 integrase(
)
gp160 precursor gp
gp120 膜表面蛋白,
gp41 穿膜蛋白
(p14),
(p19/p20)
蛋白質轉活及調節
決定病毒的感染力
抑制病毒表現
新顆粒釋放
7
HIV 基因構造 (HIV-1與HIV-2的差異)
8
HIV-1 構造 Virion Structure
9
實驗室檢測 Laboratory Test
•
•
•
•
P24抗原Antigen
抗體 Antibody
核酸 HIV-RNA (病毒載量Viral Load)
CD4/CD8淋巴球細胞T lymphocytes：正
常人的免疫細胞數量通常大於1000/mm3
• 分型及耐藥性
• 病毒培養 Viral Culture
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血清學標記Serological Markers
抗體 Detection of Antibody
• 潛伏期長 latent periord
• 空窗期 window period
抗原Detection of Antigen
•比抗體檢測提早6~7日
•第二次測得抗原，已開始轉變為受滋病
• 抗原性可持續數日或數星期， 一般在一個月下降
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抗體初篩技術
確認檢測技術
Screening test
Confirmatory test
•
•
•
•
•
•
酶免疫法
顆粒凝集試驗
斑點試驗
螢光免疫法
免疫沉澱試驗
條帶免疫試驗
• 西方印蹟法 (WB)
• 快速檢測
• 樣品 : 血
尿及唾液
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包被抗原來源Antigen derived
• 病毒溶解抗原(Whole viral lysate antigen)
• 重組的衍生抗原(Recombinant antigen)
• 合成肽抗原(Synthetic peptide antigen)
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抗體初篩檢測-Ab Screening Test
• 酶免疫分析法
– Axsym HIV combo：Recombinant HIV (E. coli)antigens & HIVp24
monoclonal (mouse) antibodies
– bioMerieux HIV-Ab+HIV-1-Ag：HIV-1 gp160, HIV-1 ANT70 peptide,
HIV-2 env peptide (amino acid 592-603) & anti-HIV-1-p24=HIV-1/HIV2/HIV-1 group O/anti-HIV-1 mixture
– Behring Anti-HIV subtype O：Recombinant HIV-1, HIV-2 & HIV-1
(Subtype O)=mixture of recombinant HIV (env) proteins (E.coli) The
proteins represent gp41 (HIV-1), gp41 (HIV1 Subtype O), gp36 (HIV-2)
– Pepti_LAV 1-2 ：Synthetic peptides 1, imitates an immunodominant
epitope of gp 41, Peptides 2, imitates an epitope of gp36.
14
酶免疫法
包被抗原
血中抗體與抗原反應
顯色反應
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快速檢測-FDA Approval試劑
OraQuick Advance
Rapid-1/2 Antibody
檢測 HIV-1 & HIV-2
Uni-Gold Recombigen
只檢測 HIV-1
Reveal G2
只檢測 HIV-2
MultiSpot HIV-1/HIV-2 分類 HIV-1 及 HIV-2
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抗體確認 Ab Confirmatory test西方印蹟法 Western Blot
原理
• 將HIV-1病毒顆粒打碎均勻溶解液 Virus
Lysate
• 在Polyacylamide gel 上電泳Gel
Electrophoresis, 使病毒各種蛋白質依分子
量大小分開
• 轉印到硝化纖維膜 Blot on Nitrocellose
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西方印蹟法 Western Blot
蛋白質抗原分子經電泳分開
血液中的抗體與抗原反應, 形成
不同的條帶
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印蹟結果之判讀
WB interpretation
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不同國際單位WB判讀準則
Criteria for interpretation of WB
機構 Institution
判讀標準 Criteria
WHO
2ENV(gp160, gp120, gp41)with or without POL
及 GAG
CDC
1ENV(gp160, gp120, gp41) & P24
FDA
1ENV(gp160, gp120, gp41) & P24 & P31
Amercian Red
Cross
* LSP
One band each of ENV, POL & GAG
2ENV(gp160, gp120, gp41)
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血清轉換 Seroconversion
2006/04/27 確認檢測－陰性
Strip 4
Strip 5
2006/05/10
2006/06/15
－P24,P160
－p24, p120, p160
第一及第二個樣本，所有含抗體
及抗原的初篩結果為強陽性，祗
含抗體的檢測則為陰性。
第一個陽性的抗原檢測為陽性，
其他均為陰性
Strip 4
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HIV 血清學診斷流程 Flow Chart -LSP
Anti-HIV 1/2 +HIV-1 Ag (EIA)
陰生N
未明確Incon
陽性P
HIV1Ag -P24 (EIA)
不同的兩種試劑, 初篩檢驗結果是陽性, 或1陽性連同1未確定
Two assay (P) or (Inconclusive)
Anti-HIV 1 & 2 分類檢測 (LIA)
Anti-HIV1 陽性 P
兩者皆陰性 Both N
Anti-HIV 1 (WB)
陰性N
陽性P
要求重新採樣, 一併進
行確認檢測 2nd sample
Anti-HIV 2 陽性 P
anti-HIV 2 (WB)
未明確Indet
陰性 N
陽性 P
未明確 Indet
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HIV抗體檢測流程圖-內地愛滋病檢測規範
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檢測正確性評價
• 假陰性結果
– 窗口期
– 血清學轉換期
– 非典型宿主反應, 原
因不明
–γ球蛋白缺乏球
–罕見毒株
• 假陽性結果
– 自身抗體
– 疫苗接種
•未明確的結果
– 初篩陽性WB只有一條P24
血清轉換期 P24抗體先出現
共同抗體的交叉反應
O群或HIV-2感染
HIV 疫苗接種
Multiparity
Autoimmune disease
 反複檢測呈現持續的一條帶多
24
數原因不明
未明確的結果
9月1日第一個陽本兩初篩呈弱陰性 ，WBp24
9月20日第二個樣本， WB-P24
25
報告
• 初篩
– Anti-HIV-1/2+HIV-1Ag ~ 陰性
• 確定性
– Anti-HIV-1/2+HIV-1Ag or Anti-HIV 1/2 ~陽性
– HIV-1 Ag ~ 陰性 or 陽性
– Anti-HIV-1 確定性 ~ 陽性
• 第二個樣本報告只發出確定性檢測結果
• 對初篩陽性及確定性檢測為未明確只報告確定
性檢測結果
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HIV 感染後的跟進檢測Follow up
• CD4/CD8 (流式細胞法 Flow Cytometry)
– CD4代表T輔助細胞
– CD8代表T抑制細胞和T殺傷細胞, 分泌物質抑制病毒複
制
– CD4是HIV感染的主要靶細胞, 又是免疫反應的中心細胞
– CD8是免疫反應的效應細胞
– EDTA-K3全血，採檢後24小時必須進行檢測
– T淋巴細胞T-lymphocyte在每3~6個月進行監測
– 一般人群的CD4+T淋巴細胞是800~1200/mm3
– 低於200/mm3 易發生機會性感染或癌症
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CD4細胞數
>500/mm3
200~500/mm3
<200/mm3
CD4細胞百分率
>29 %
14%~28%
<14 %
•減少測量的變異
28
流式細胞儀 Flow Cytometry
•在液流中的細胞或其它生物微粒逐個進行多
參數 的快速定量分析和分選的技術
•使用多色單克隆抗体與全血樣本中，淋巴細
胞表面抗原結合，進行多色分析，以區分各
管中加入已知數量的標準螢光微球，就可計
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出細胞亞群的絕對含量 (Cell/mm3)
流式細胞儀
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T淋巴細胞與病程
WELL
PGL全身
性持續淋
巴腺病變
ARC 愛滋
病相群關
愛滋病
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病毒載量-核酸的檢測
Viral Load
• 評估 Assessing
– 疾病進程Disease prognosis
– 治療開始及治療效果的評估Initiating &
evaluation of antiretroviral therapy治療後的病
毒載量一般長期處於非常低的水平
– 感染孕婦所生嬰兒的早期診斷Transplacental
transmission
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核酸檢測技術
Technology of Nucleic acid
• PCR 聚合酶鏈反應
• bDNA 支鏈 DNA信號放大技術
• NASBA 核酸序列擴增系統
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病毒量測定 Viral Load
• 聚合酶鏈反應 PCR
– 在生物體外，核酸放大反應，定量人體血漿中的愛
滋病病毒(HIV-1 RNA Amplication in vitro)
– 擴增的亞型 : M A-G亞型
– 引物Primer : HIV gag區域SK145/SKCC1B
– 6小時內分出血漿，存於 -70 ºC, 避免RNA降解
– 不用於篩檢,也不單獨當作確認HIV-1感染的診斷
– Not screening test
– RNA定量檢測時未測出不等於樣品中不含病毒RNA,
每種方法有其可測出的檢測限，一般為50~100拷貝
數/mL
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– 高靈敏度使容易因污染造成結果的錯誤
聚合酶鏈反應 PCR
抽取核酸物質
加入擴增所需元素
檢測產物
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RNA 與病程的關係
Patients Developing AIDS or Dying of AIDS with years, based on
Initial HIV RNA Levels
HIV RNA
<500 501Copies/mL
3000
% developing 5.4
16.6
of AIDS:
% dying of
0.9
6.3
AIDS
300110000
31.7
1000130000
55.2
>30000
18.1
34.9
69.5
80.0
36
CD4 T淋巴細胞 與 病毒載量
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CD4+ & HIV-RNA 新感染個案
InDate
CD3
CD4
CD8
HIV1Ag
HIV1RQ
2006/5/
0
0
0
N
0
2005/6/
0
0
0
N
0
2005/10/
1086
372
629
14700
2006/02/
1227
400
719
10300
2006/09/
906
332
537
18700
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HIV 感染的自然史和病程分期
• 體內播種期
• 急性逆轉錄病毒綜合症期;CD4+急劇下降
及病毒血症
• 血清轉換期
• 無症狀HIV感染期 (臨床潛伏期)
• 愛滋病前期 (ARC)
• 愛滋病期 (AIDS) : CD4+<200/mm3
• 愛滋病晚期 : CD4+<50/mm3
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Profile of HIV Infection
Late Stage:Core Ab
Declines and becomes Neg
Envelope Ab:Positive
HIV Ag Becomes positive
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HIV/AIDS診斷diagnosis
臨床分類
CD4細胞數范圍
A
無症狀HIV感
染期
B
愛滋病前期
C
愛滋病期
>500/mm3(>29%)
A1
B1
C1
200-499/mm3
(14%-28%)
A2
B2
C2
<200/mm3(<14%)
A3
B3
C3
• 所有屬於A3, B3和C1~C3均報告為愛滋病
41
基因變異性 Mutation
• HIV 快速複製以及在反轉錄過程中的缺
失及修補, 造成不同的變異variants 及品
株Strains
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亞型分析目的
Purpose for typing
 鑑別特定病毒亞型在人群和個體間的
傳播, 全球地區分布特點
 推動流行株疫苗的研究
 揭示HIV的變異方式
利用GAG, POL及ENV的基因序列分析, 區分基因亞型
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HIV Subtype
• HIV-1及HIV-2
• HIV-1
– M group (10種亞型:A~k)
– N group
– O group
• HIV-2 (主要分布在西非及印度)
– 6種亞型 (A~F)
• HIV-2分離株與SIV常有同樣的抗原,在所有的外套模蛋
白質及核心蛋白皆發現異質性只有30%,但是與HIV-1的
外套模蛋白比較,僅存有40%的同源性
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HIV-1亞型分佈
Distribution of Subtype
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
東歐(一半B型, 另一半A、D、C、F、G)
北美、澳洲、巴西及西歐(B亞型)
非洲(A和D型)
中非(A~H型)
南非(C亞型)
泰國(B及E亞型)
印度(A、B、C亞型)
韓國(A、B亞型)
南美洲 (B、 F亞型)
中國 (B、C 、Ｅ亞型)
* 澳門已檢測樣本是
CRF01_AE 、 CRF12_BF 、
B 、 CRF08_BC 、B’ 、A1 、
A 、CRF14_BG
• 泰國 (CRF01_AE)
• 阿根廷及巴西BF重組亞型
45
基因多種性因突變及基因重組
• 宿主同時感染兩種不同的亞型, 造成新的
基因重組型
• 病毒被命名為CRF (如CRF01_AE), 如由
三種或者更多的亞型所重組 以cpx表示
• 有十多種CRF01_AE, CRF02_AG,
CRF04_cpx等等
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HIV亞型分析流程圖
DNA模板的提取
巢式PCR
PCR 產物回收
PCR產物純化和變性
測序步驟
電泳
核酸全測序儀進行測序和分析
電腦軟件作HIV亞型分析
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HIV耐藥性檢測 Drug Resistance
測量HIV對抗病毒藥物抗性的體外實驗
• 有助於醫生選擇治療方案
• 檢測初次用藥的HIV感染者其耐藥情況
• 用藥過程中產生的耐藥情況
北美及西歐有10%的HIV-1病毒的初感染者對最少1種
藥物有抗藥性 (Medscape 2006/07/21)
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早期治療的優點
•
•
•
•
•
•
控制病毒複制
預防進行性免疫缺損
延緩病的進展和死亡
預防產生耐藥性
較好的藥物耐受性
減少病毒傳播
延遲治療的缺點
•
•
•
•
•
•
生活質量無明顯改善
較早出現耐藥性
限制將來藥物的選擇
長期的藥物毒性
有效持續時間不明
耐藥毒株的傳播風險
降低血中病毒載量, 重建病人免疫系統功能
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抑制物-Inhibitor
50
病毒培養 Viral Culture
• 血中培養出病毒為最直接的證據
• 涉及較多的安全設備, 需在P3實驗室進行
• 收集健康人的血液單核細胞(PBMC)與病
患者的血球共同培養
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分析方法之評估
Evaluation of Assay Verification Issues
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
敏感度Sensitivity
特異性Specificity
重覆性Reproducibility
簡便Simplicity
價錢及效能Cost/benefit
穩定性Stability
準確度Accuracy
精確度Precision
容易使用Ease of use
陽性預測值Positive Predictive Value (%)
陰性預測值Negative Predictive Value (%)
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結語Conclusion
病源檢測面對的問題
Problems with Etiological Diagnosis
• 無一種檢測可達到100%的靈敏性及特異性
No diagnostic test is 100% specific and 100%sensitive
• HIV-1變異株的GAG及POL與主要的分離株基因比較，只
有70%的同源性;而ENV則僅有50%的同源性。這些變異
造成檢驗試劑無法診斷出某些感染者
HIV Highly variable; gag and pol share 70% amino acid
sequence homology in some strain, env is 50%. Infection is
not detected
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