Transcript Microbiologia bolii parodontale •

Microbiologia bolii parodontale
• Boala parodontală - cea mai frecventă
condiţie inflamatorie cu caracter distructiv
din patologia umană.
• Infecţie produsă de specii bacteriene care
interacţionează cu ţesuturile şi celulele
gazdei ducând la eliberarea de citokine
si alţi mediatori ai inflamaţiei, având
drept consecinţă distugerea structurilor
parodontale.
Notă: imaginile preluate de pe internet, fără sursă
bibliografică au fost şterse pentru a nu exista nici un
aspect care să fie asociat plagiatului. LS Iancu
Clasificarea bolii parodontale
• 1999 ADA (American Dental Association)
1.Gingivita
asociată cu biofilmul bacterian
neasociată cu biofilmul bacterian
2.Parodontita cronică (PC)
localizată
generalizată - >30% din dinţi
afectaţi
sunt
Clasificarea bolii parodontale
3. Parodontita agresivă (PA)
• localizată
• generalizată >30% din dinţi sunt afectaţi;
 Severitatea se apreciază pe baza adâncimii pungii (PD =
periodontal pocket depth) şi a pierderii de ataşament gingival
(CAL = clinical attachment level):
 uşoară 1 ~2 mm;
 medie 3 ~ 4 mm;
 severă ≥ 5 mm;
4. Parodontita din bolile sistemice
5. Boala parodontală necrozantă (BPN)
• gingivita ulceronecrotică
• parodontita ulceronecrotică
Clasificarea bolii parodontale
6.Abcese ale ţesutului periodontal
• abces gingival
• abces parodontal
• abces pericoronal
7.Parodontita asociată cu leziuni
endodontice
Clasificarea bolii parodontale
• Modificări aduse de această clasificare:
• “parodontita adultului” a fost înlocuită cu
“parodontita cronică”;
• eliminarea termenilor de “parodontită
recurentă” şi “parodontită refractară”;
• înlocuirea termenului de “parodontită cu
debut precoce” cu “parodontita agresivă”;
• înlocuirea termenului de “parodontită
ulcero-necrozantă” cu “boala parodontală
ulcero-necrozantă”
Biofilmul dentar asociat cu boala
parodontală
• Începutul secolului trecut - consecinţa
acumulării plăcii subgingival şi a diminuării
răspunsului imun, precum şi a creşterii
susceptibilităţii odată cu vârsta.
Etiologia bolii parodontale
• Teoria nespecifică - boala parodontală
este rezultatul elaborării de produşi toxici
de către întreaga flora a plăcii.
• Teoria specifică - anumite tipuri de
placă sunt patogene iar patogenitatea
depinde de prezenţa sau de numărul mare
al unor microorganisme specifice.
Teoria „ecologică”
– boala parodontală este rezultatul modificărilor
habitatului (nutrienţi, pH, potenţial redox):
• selecţia
bacteriilor
patogene
este
influenţată direct de schimbările de mediu;
• boala nu are o etiologie specifică; orice
specie cu anumite caracteristici poate
contribui la evoluţia bolii.
Teoria „ecologică”
• Astfel semnificaţia clinică a speciilor nou
descoperite poate fi stabilită pe baza
caracterelor fiziologice ale fiecăreia dintre ele.
• Boala poate fi prevenită nu numai prin atacul
ţintit asupra patogenilor parodontali ci şi prin
interferarea cu presiunea selectivă a factorilor
de mediu responsabili de înmulţirea lor.
Grupurile de bacterii din biofilmul dentar
subgingival
Grup
Grupul violet
Grupul galben
Grupul verde
Grupul
portocaliu
Grupul roşu
Specii bacteriene
Veillonella parvula
Actinomyces odontolyticus
Streptococcus spp.
Eikenella corrodens
Capnocytophaga spp.
P. intermedia/ nigrescens
Micromonas micros
Campylobacter rectus
Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas gingivalis
Tannerella forsythia, Treponema denticola
Criterii de identificare a patogenilor
parodontali
Potenţialul patogen trebuie:
• să fie asociat cu boala, prin creşterea ca
număr în situs-ul afectat de boală;
• să fie eliminat sau să scadă ca număr în
situs-urile cu evoluţie clinică bună sub
tratament;
• să ducă la apariţia unui răspuns imun din
partea gazdei;
Potenţialul patogen trebuie:
• să fie capabil să producă boala la un
animal de laborator;
• să aibă factori de virulenţă responsabili de
distrugerea ţesutului parodontal;
• în lipsa inoculării de patogeni parodontali
la animalele germ free nu trebuie să apară
gingivite sau parodontite.
Microbiologia bolii parodontale
• Numărul total al bacteriilor din placa
subgingivală este de 2 ori mai mare în
starea de boală comparativ cu starea de
sănătate, răspunsul imun fiind crescut în
prima situaţie.
• Şi morfotipurile bacteriene diferă în cele 2
situaţii: în starea de sănătate sunt mai
puţine spirochete, bacili gram negativi
decât în starea de boală.
Patogen
Sănătate
PA
PC
BPN
Streptococcus
+++
+
+
+
Actinomyces
+++
+
+
+
Veillonella
+
+
+
+
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans
-
++
+
?
Capnocytophaga
+/-
+/-
+/-
+/-
Treponeme orale
+/-
+++
+++
+++
Porphyromonas gingivalis
-
+
++
+/-
Prevotella intermedia
+/-
+
++
++
Tannerella forsythia
-
++
++
?
Fusobacterium nucleatum
+
+
++
++
Concluzie:
- biofilmul dentar subgingival al stării de
sănătate
poate găzdui în cantităţi
foarte mici patogeni parodontali, ei fiind
incapabili să concureze cu bacteriile
gram pozitive zaharolitce dominante.
• La acumularea biofilmului, răspunsul inflamator
•
•
care apare duce la creşterea fluxului lichidului
crevicular gingival cu alterarea status-ului
nutriţional local
acesta duce la înmulţirea bacteriilor proteolitice
gram negative, creşterea pH-ului şi scăderea
potenţialului redox.
Proteazele interferă cu controlul gazdei asupra
răspunsului inflamator, agravat şi prin creşterea
continuă a masei bacteriilor gram negative.
• Biofilm subgingival– stare de sănătate –
domină bacterii gram pozitive zaharolitice;
• Biofilm subgingival – inflamaţie – domină
bacteriile gram negative proteolitice.
• Trecerea de la gingivită la parodontită
depinde de 3 factori:
 susceptibilitatea gazdei;
 prezenţa bacteriilor patogene;
 prezenţa bacteriilor „protectoare”;
Motivele care fac ca etiologia bolii
parodontale să nu fie pe deplin
elucidată:
• diversitatea speciilor bacteriene din placa
subgingivala asociată bolii parodontale,
• variaţiile în compoziţia florei de la un
individ la altul,
• diferenţele în răspunsul gazdei la acţiunea
diferitelor specii bacteriene, etc.
Asocierea bacteriilor suspectate cu boala parodontală
Foarte puternică
Puternică
Moderată
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans
Fusobacterium
nucleatum
Streptococcus
constellatus
Porphyromonas gingivalis
Prevotella
intermedia
Parvimonas micra
Tannerella forsythia
Campylobacter
rectus
Actinomyces
viscosus
Treponema denticola
Eikenella
corrodens
Actinomyces
odontolyticus
www.topleyonline.com
Microbiologia bolii parodontale
• Microbiota parodontală –sistem ecologic
complex, cu multe interacţiuni structurale
şi fiziologice între bacteriile rezidente şi
între bacterii şi gazdă.
• Nivele crescute ale unor bacterii –
consecinţa bolii.
• Lipsa leziunii – număr mic de bacterii,
susceptibilitate scăzută a gazdei, diferenţe
de virulenţă intraspeciii.
Microbiologia bolii parodontale
• Bacteriile “protectoare”:
• ocupă spaţiul vital ce ar putea fi populat
de bacteriile patogene;
• inhibă aderenţa bacteriilor la parodonţiu;
• inactivează anumiţi patogeni.
Rolul virusurilor în boala
parodontală
• Citomegalovirusul (CMV) şi virusul Epstein-
Barr (VEB):
• efect citopatic pe fibroblaşti, celule
epiteliale, celule inflamatorii;
• supresia mecanismelor de apărare a
parodonţiului care permite multiplicarea
patogenilor parodontali;
• alterarea micromediului care devine propice
pentru înmulţirea patogenilor parodontali;
Mecanisme patogenice în
boala parodontală
• Adeziunea, coagregarea, invazia;
• Producerea de exotoxine;
• Constituienţii celulari;
• Producerea de enzime;
• Eludarea răspunsului imun;
Metode de diagnostic microbiologic în boala
parodontală
Microscopia optică:
– cu fond luminos
– cu fond negru
– cu contrast de fază
Cultivarea
Tehnici PCR
Teste imunoenzimatice – ELISA, BANA
Imunofluorescenţa
Gaz lichid cromatografie
Alte teste
Diagnostic microbiologic
1.


•
•
•
•
Recoltare:
Proba – biofilm bacterian subgingival;
Etape:
izolarea dintelui;
îndepărtarea mecanică a plăcii supragingivale;
uscare;
recoltarea probei cu ajutorul conurilor de hârtie
de filtru.
2.Transport:
- maxim 30 minute;
- mediu de transport : bulion thioglicolat cu
resazurină.
3. Incubare - 37°C în anaerobioză, 5-7 zile.
Examenul microscopic
Frotiuri colorate Gram
• rapid, ieftin şi util
•
•
pentru pacient;
rol în stabilirea
prognosticului;
justifică continuarea
investigaţiei microbiologice.
Microscopia cu fond negru şi
contrast de fază
• Nu diferentiază între treponeme patogene şi
comensale
- Frotiul Gram: placa bacteriană asociată cu starea
de sănătate parodontală este compusă din coci, Gram
pozitive.
- O creştere relativă a numărului de bacili Gram
negativi, de formă şi dimensiuni variabile este legată
de apariţia gingivitei iar flora abundentă constituită
din bacili Gram negativi la care se asociază un
număr mare de spirochete se asociază la rândul
său cu parodontita adultului.
- Prezenţa spirochetelor este direct proporţională cu
adâncimea pungii parodontale, acestea fiind teoretic
absente în cazul unui parodonţiu sănătos.
• Recoltarea probele din pungile parodontale de la pacienţi cu
•
•
•
•
•
•
–
–
–
diagnostic clinic de parodontită marginală cronică.
Recoltarea se face cu conuri de hârtie sterile de 20 de mm ce au
fost menţinute timp de 30 secunde în punga parodontală după
îndepărtarea prealabilă a plăcii bacteriene supragingivale, pentru a
se evita contaminarea probei cu flora supragingivală.
Conurile se descarcă în tuburi sterile cu 0,5 ml ser fiziologic steril.
b. Examinarea microscopică
Din suspensia obţinută în ser fiziologic, se prelevă volume
standardizate cu ajutorul unei anse calibrate de 10μl, volume care
se folosesc pentru prepararea frotiurilor.
Frotiurile se colorează Gram şi se examinează la microscop.
Aspectele oferite de examinarea unui frotiu colorat Gram folosite
drept criterii de evaluare pot fi:
încărcătura bacteriană a probei;
prezenţa florei Gram negative (bacili);
prezenţa treponemelor orale.
Alte sisteme de identificare
• Detectare de enzime preformate (constitutive)
cu substrate cromogene sau fluorogene –
Rapid ANA, Rapid ID 32 A, BBL Crystal, API
ZYM
• CDC –Presumpto plates I, II, III – agar
Lombard Dowell
• Microbe Lynx System – spectroscopie de masă
• TOPAS (Toxic OralPathology Assay) este
produs de catre ALT Bioscience U.S.A. şi
reprezintă un test de toxicitate bisecvenţial, colorimetric, care se face extemporaneu, în cabinet şi care se bazează pe
detectarea a doi markeri ai infecţiei
bacteriene la nivelul fluidului crevicular
gingival. Sursa slide-uri 34-40: REVISTA ROMÂNĂ DE STOMATOLOGIE
– VOL. LIV, NR. 2-3, AN 2008 121
Iniţial, testul TOPAS este desemnat să detecteze prezenţa toxinelor
bacteriene din lichidul şanţului gingival.
Aceste toxine sunt produşi de metabolism ai bacteriilor anaerobe
patogene ce apar la nivelul siturilor bolnave, active, de la nivelul şanţului
gingival şi al feţei dorsale a limbii şi includ compuşi volatili ai sulfului
(hydrogen sulfurat şi metil-mercaptan) şi poliamide (putresceina şi
cadaverina), toxine ce au fost arătate a se afla în concentraţii extrem de
mari la nivelul siturilor parodontale infectate şi active.
Principiu
Acest test se bazează pe reacţia dintre toxinele microbiene şi un
amestec de reactivi chimici din care rezultă un produs de culoare
galbenă a cărei intensitate colorimetrică este direct proporţională
cu concentraţia de toxine microbiene din mostra recoltată.
• Cea de-a doua parte a testului TOPAS este desemnată să detecteze
nivelul crescut al proteinelor totale din lichidul crevicular.
• Aceste proteine totale includ atât proteine bacteriene, cât şi proteine
inflamatorii de tipul anticorpilor şi proteinelor serice umane
(albumina serică) şi asta se datorează faptului că infecţia bacteriană
creşte nivelul acestor proteine pe măsură ce lichidul şanţului gingival
se transformă dintr-un transsudat seric sărac în proteine într-un
exudat seric bogat în proteine, această creştere provenind atât de la
gazdă, cât şi de la microorganismele ce se dezvoltă în număr mare
la nivelul sitului infectat.
• Cu cât nivelul proteinelor totale este mai mare, cu atât reacţia de
culoare albastră va fi mai intensă; trebuie remarcat faptul că
sângele sau saliva pot contamina mostrele recoltate şi afecta
rezultatele testului în sensul indicării unui nivel mai crescut de
proteine.
• TOPAS este calibrat folosind hidrogenul sulfurat (H2S)
•
•
astfel încât standardele de toxicitate variaza de la 0mM (nu
există toxicitate) şi până la 2 mM (toxicitate severă).
În plus faţă de H2S, TOPAS detectează şi prezenţa altor
compuşi sulfhidrici de tipul mercaptanului (CH3 SH),
dimetilsulfidelor (CH3 S CH3) şi dimetildisulfidelor (CH3 SS
CH3) precum şi toxine fungice ce reacţionează cu thiolul,
de tipul gliotoxinei.
În plus, TOPAS reacţionează cu poliamide de tipul
cadaverinei şi putresceinei, producând o coloraţie galbenă.
• TOPAS este de asemenea desemnat să detecteze nivele crescute
de proteine de la nivelul lichidului şanţului gingival şi care
sunt caracteristice siturilor parodontale active; aceste proteine
provin din surse microbiene, surse locale produse de factori ai
organismului gazdă (de tipul anticorpilor, albuminei serice, aspartat
aminotrans-ferazei, betagluconidazei şi fosfatazei alcaline) şi din
protein serice.
• Această a doua fază a TOPAS se bazează pe colorarea acestor
proteine cu pigmenţi albaştri, intensitatea culorii fiind direct
proporţională cu cantitatea de proteine de la nivelul lichidului şan• ţului gingival.
• TOPAS este calibrat în acest sens folosind albumina serică umană ca
standard proteic, cu nivele de la non-detectabil (<5 microgr.) până
la abundent (>50 microgr.) şi asta deoarece albumina serică este
considerată ca fiind cea mai abundentă proteină de la nivelul
lichidului şanţului gingival, atât la nivelul situsurilor sănătoase, cât şi
la nivelul celor bolnave.
• a. Recoltarea
• Determinările cu testul TOPAS se fac obligatoriu înainte de orice altă
•
•
•
•
procedură terapeutică dentară.
Se usucă situs-ul din care se va face recoltarea cu meşe sterile
sau cu un jet de aer de la unitul dentar, cu scopul de a îndepărta
orice posibilitate de contaminare externă fluidă cu salivă înainte de
recoltare.
Se scot conurile de hârtie din pachetul steril.
Dacă suntem interesaţi de statusul unui anume dinte, atunci
recoltarea mostrelor de lichid crevicular gingival se va face la nivelul
şanţului atât mesiovestibular cât, şi mesiolingual. Dacă suntem
interesaţi de o anumită pungă parodontală, atunci recoltarea se va
face de la nivelul acesteia.
Se inseră conurile de hârtie în interiorul şanţului gingival, respectiv
al pungii parodontale, direcţionând vârful conului de hârtie apical
până când se simte o rezistenţă uşoară. Se lasă conul de hârtie pe
loc timp de 1 minut, după care se agită uşor tubul cu capacul
galben pentru determinarea toxicităţii în scopul aşezării reactivului
din interior pe fundul acestuia. Se desface capacul şi se aşază în
poziţie verticală în stativ.
• b. Determinarea propriu-zisă
• După 1 minut se plasează imediat conul de hârtie în tubul cu reactiv asigurându-ne că
•
•
•
•
•
vârful conului este submers în totalitate în reactivul respectiv.
Se închide tubul cu capacul pentru a împiedica evaporarea eventualelor toxine
volatile, după care se agită uşor tubul în vederea amestecării compuşilor din lichidul
şanţului gingival cu soluţia de reactiv. Se lasă tubul în repaus timp de 5 minute până
când se formează culoarea galbenă de reacţie, după care se măsoară cu ajutorul
scalei de toxicitate; cu cât culoarea galbenă este mai intensă, cu atât nivelul de
toxine bacteriene din lichidul şanţului gingival este mai ridicat.
Apoi se deschide capacul albastru de la tubul cu reactiv pentru proteine şi se toarnă
în tubul cu capac gaben, cel cu reactiv pentru toxine. Se pune din nou capacul
albastru şi se agită viguros conţinutul tubului, se lasă timp de 2 minute pentru a se
produce colorarea.
Este necesară cronometrarea exactă la 2 minute, deoarece colorarea continuă în timp
şi depăşirea termenului poate să ducă la obţinerea de rezultate false!
Dacă mostra de lichid crevicular conţine proteine, soluţia va vira de la o
culoare aquamarine (albastru deschis) la o culoare albastru închis; cu cât
mostra conţine mai multe proteine, cu atât reactivul va avea o culoare mai intensă de
albastru închis iar determinarea se va face cu ajutorul scalei de proteine.
GLC –gaz lichid cromatografie
• Evidenţiază produşi finali ai metabolismului
bacterian:
acizi graşi cu lanţ scurt
acizi graşi cu lanţ lung
Tehnici
de
biologie
moleculară
real time PCR
Micro-Ident
Micro-Ident
- Testul micro-IDent A face posibila determinarea celor cinci
markeri importanti parodotogeni: Aggregatibacter actino-
mycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Bacteroides forsythus si Treponema denticola).
- In unele cazuri de parodontita spectrul de diagnostic poate fi
largit prin determinarea altor 6 germeni: Peptostreptococcus
micros, Fusobacterium nucleatum/periodonticum, Eikenella
corrodens, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum si
Capnocytophaga spp (testul micro-IDent B).
Testele micro-IDent sunt utile pentru:
- identificarea zonelor cu risc si recunoasterea precoce
a recidivelor;
- alegerea antibioticului adecvat si documentarea
succesului terapeutic;
-evaluarea riscului de implant nereusit inaintea
tratamentului.
Sursa slide-uri 44 – 46: REVISTA ROMÂNĂ DE STOMATOLOGIE –
VOL. LIV, NR. 2-3, AN 2008 121
Specimen recoltat – prelevarea probei se face de către medicul
stomatolog cu ajutorul beţişoarelor de hârtie conţinute in trusa de
recoltare, obligatoriu înaintea tratamentului mecanic sau cu
antibiotice.
-Cu ajutorul unei pense sterile se introduce un beţişor in punga
parodontala până la baza acesteia (adâncimea pungii parodontale
trebuie sa fie de cel puţin 4 mm).
- Beţişorul va rămâne pe loc timp de 10 secunde, dupa care va fi
retras si introdus in intr-un tub de transfer.
-Se pot recolta maxim 4 probe din pungi parodontale diferite.
-Toate betişoarele provenite de la acelasi pacient vor fi introduse
intr-un singur tub de transfer.
-Tubul va fi plasat in trusa albastra de recoltare împreuna cu o fişă
care contine datele pacientului.
-Transportul catre laborator nu ridică probleme, fiind vorba de
determinarea ADN.
Stabilitate proba – 1 săptămâna la 2-8°C. (http: synevo.ro)
Interpretarea rezultatelor
In cazul detecţiilor ADN pozitive, pentru fiecare
bacterie patogenă rezultatul va fi raportat astfel:
-“slab pozitiv”,
-“pozitiv”,
-“intens pozitiv”.
Aceste moduri de comunicare se coreleaza cu
cantitatea de germeni identificati in probă.
ELISA
BANA
• Test colorimetric
• Testul pozitiv – indică prezenţa
Treponema denticola, Porphyromonas
gingivalis, Bacteroides forsythus în
probă.
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 1990, p. 1551-1559
WALTER J. LOESCHE, et all
• Treponema denticola, Porphyromonas (Bacteroides)
gingivalis, and Bacteroides forsythus are among the
• anaerobic species frequently associated with adult forms
•
of periodontal disease.
These organisms hydrolyze the synthetic peptide
benzoyl-DL-arginine-naphthylamide (BANA), and such
enzyme activity can be detected in the plaque and
related to clinical disease and the presence of
spirochetes.
• …..In this investigation, the liquid BANA assay was
compared with a commercially developed BANA assay
which employed a paper format and which could be read
after a 15-min incubation.
TESTUL BANA este o adaptare a testului de hidroliza BANA
conceput de Dr. Walter Loesche (Univ. Michigan) care se bazeaza
pe detectarea unei enzime care este secretata de Porphyromonas
gingivalis, Treponema denticola si Bacteroides forsythus, cele trei
bacterii anaerobe frecvent asociate cu parodontita adultului sau cu
halena fetida.
-Din 60 de specii subgingivale studiate [Manabu M, 2001] doar
acestea trei secreta aceasta enzima capabila sa hidrolizeze peptidul
sintetic benzoil-DL-argininnaftilamida (BANA) cu care este
îmbibata banda test.
-Daca oricare din aceste trei specii este prezenta se produce
hidrolizarea enzimei BANA si apare culoarea albastra, indicatorul
testului pozitiv.
- Cu cât este culoarea mai intensa cu atât concentraţia microorganismelor BANA pozitive este mai mare.
-Testul BANA poate detecta simultan prezenta uneia, a doua sau a celor
trei microorganisme, cu aceeasi acurateţe ca si sondele ADN, testul
ELIZA sau imunofluorescenta indirecta [Loaesche WJ, 1992]. Sensibilitatea acestor trei metode este de 90-96 % iar acuratetea de 8392 %.
-În acelasi studiu comparativ efectuat de Loesche metoda detectarii
acestor microorganisme prin culturi microbiene a avut o acuratete de 5062%.
Imunofluorescenţa
Alte tehnici
• FISH (Fluorescence in situ
hybridization) –hibridizare fluorescentă
in situ
• Electroforeză în gel de poliacrilamid
duodecil sulfat
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/fish.php
Metoda FISH (fluorescence in situ hybridization)- este utilizată pentru
analiza ADN prin vizualizare directă pe preparate microscopice celulare sau
cromosomiale.
Se vizualizează simultan caracteristicile genotipice şi fenotipice a celulelor
şi alecromosomilor.
Se ultilizează molecule de ADN monocatenar specific marcat radioactiv sau
chimic (unnucleotid fluorescent) cu fluorocromi= sonda ADN- sonda ADN
are capacitatea de a se ataşa de secvenţa ADN complementară indiferent
undeeste situată aceasta în genom.
Sonda marcată poate fi asociată cu anticorpi monoclonali=> utilizarea mai
multor fluorocromi, creşterea intensităţii semnalului (ADN = antigen).
Poate marca: cromozomi metafazici; nuclei interfazici; cromozomi elongati;
fibra de cromatină.
Sursa slide-uri 55- 56: REVISTA ROMÂNĂ DE STOMATOLOGIE – VOL. LIV, NR. 2-3, AN
2008 121
SDS-PAGE (PAGE = poliacrilamid gel electroforeza)
Electroforeza constituie o metoda rapida de cuantificare,
comparare si caracterizare a puritatii proteinelor, ADN-ului
sau ARN-ului.
Principiul electroforezei: moleculele incarcate (proteine,
acizi nucleici) se deplaseaza de-a lungul unui gel intr-un
camp electric.
Gelul este asemeni unei site moleculare care permite
moleculelor mai mici sa se deplaseze mai rapid, iar celor
mai mari sa inainteze mai lent.
Amestecurile de proteine sunt separate prin intermediul
SDS-poliacrilamid electroforezei (eng. SDS = sodium
dodecyl sulfate - dodecil sulfatul de sodiu). Tehnica a fost
introdusa de Shapiro si colaboratorii in 1967.
Acizii nucleici sunt separati de obicei folosind geluri de
agaroza.
Concluzii
• Cultivarea şi PCR – cele mai folosite.
• Nici o metodă nu poate fi considerată “per
se “ de referinţă.
• Combinarea de teste – cea mai buna
“metodă”.
Antibiograma
• Antibiograma ATB ANA (BioMerieux) – nu mai este
acceptată
• EX: ATB ANA susceptibility test. The ATB ANA strips (bioMérieux, Marcy
l’Etoile, France) permit determination of the susceptibility of anaerobic bacteria
to antibiotics in a semisolid medium under conditions similar to those used for
the agar dilution method. A suspension of no. 3 McFarland standard was
prepared by homogenizing without shaking C. difficile colonies in 0.85% saline
buffer, and 200 μl was transferred into an ampoule of ATB-S medium; 135 μl
was then distributed into each cupule of the strip containing dehydrated
antimicrobial agents. The strips were incubated for 24 h at 37°C in an anaerobic
atmosphere. The turbidimetries of the cupules were observed by visual reading,
and interpretation was performed according to the manufacturer’s
recommendations. The breakpoints to be used for interpretation of the results
were as follows: 1 to 4 μg/ml for erythromycin, 2 μg/ml for clindamycin, 8 μg/ml
for tetracycline, 4 to 16 μg/ml for rifampin, and 16 μg/ml for chloramphenicol.
Sistemul Vitek si E-Test
• Abstract:
• Abstract. The aim of the present investigation was to determine the
•
susceptibility of Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis,
Fusobacterium and Peptostreptococcus micros to metronidazole in vitro.
Two methods were applied on each isolated strain: agar dilution and
epsilometer Etest®. A total of fifty three wild test strains (13 P.intermedia,
14 P.gingivalis, 14 F.spp and 12 P.micros) were isolated from patients with
periodontitis. The Etest® appears to be a simple, rapid and reliable method
for the metronidazole susceptibility testing. The results show that all
P.intermedia, P.gingivalis and F.spp strains were susceptible to
metronidazole. The mean values of minimal inhibitory concentration
obtained with the agar dilution method were, respectively, 0.98 g/ml,
0.122 g/ml and 0.242 g/ml. For P. micros, the minimal inhibitory
concentration was of 12.14 g/ml. Comparatively to break points, only 60%
of P.micros strains seem to be susceptible, in vitro, to metronidazole. This
study demonstrated the excellent activity of metronidazole against
P.intermedia, P.gingivalis, F.spp except perhaps for P.micros.
Keywords: metronidazole; minimal inhibitory concentration; anaerobic
bacteria; periodontal disease; human study
Terapia cu antibiotice
• Antibiotice – beneficiu versus folosire în
exces cu afectarea ecologiei orale.
• Scop: controlul biofilmului, nu eliminarea
lui.
• Sensibilitatea la antibiotice a patogenilor
parodontali variază considerabil, terapia
empirică este, deci, dificilă.
• Sensibilitatea bacteriilor componente ale
biofilmului diferă de cea a bacteriilor în
stare planctonică din cauza:
penetrabilităţii scăzute a antibioticelor în
structura biofilmului;
bacteriile din biofilm pot avea ţintele de
atac ale antibioticelor modificate, sau chiar
pot lipsi;
straturile profunde ale biofilmului pot
constitui un mediu nefavorabil acţiunii
antibioticelor.
Categoriile de pacienţi ce pot beneficia
de antibioterapia sistemică:
•
•
•
•
•
•
pacienţii cu parodontite agresive;
pacienţii cu parodontite cronice severe;
pacienţii cu parodontită cu manifestări sistemice;
parodontite cu pierderi progresive de ataşament
după tratament corect;
abces parodontal cu extinderea în lojile
învecinate şi adenopatie severă;
boala parodontală necrozantă cu starea generală
influenţată.
Cum alegem un antibiotic?
• În funcţie de identitatea patogenilor
parodontali.
• În funcţie de sensibilitatea in vitro a
patogenilor parodontali.
Terapia sistemică cu antibiotice
• Metronidazol: 3x500mg, 7-10 zile
• Amoxicilină: 3x500mg, 7-10 zile
• Amoxicilină + acid clavulanic: 3x500mg, 710 zile
• Clindamicină: 4x300mg, 7-10 zile;
• Metronidazol+amoxicilină+acid clavulanic;
Terapia cu antibiotice
• Penicilina, amoxicilina:
bactericide;
50% din bacilii gram negativi anaerobi
produc β lactamaze.
asocierea cu acid clavulanic.
Terapia cu antibiotice
• Clindamicina:
acţiune foarte bună pe anaerobi;
Toate tulpinile de Eikenella corrodens şi
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
sunt rezistente;
Terapia cu antibiotice
• Tetraciclina:
spectru larg;
bacteriostatic;
multe tulpini de anaerobi au dobândit
rezistenţă;
Terapia cu antibiotice
• Metronidazol:
antibioticul de elecţie în infecţiile produse
de anaerobi;
nu acţionează pe facultativi anaerobi (E.
corrodens, A. actinomycetemcomitans).
Tratament local
• Produse
cu eliberare controlată de
tetraciclină, metronidazol (geluri, polimeri,
fibre).
• Antiseptice: hipocloritul de sodiu,
clorhexidina, compuşi cationici biguanidici,
hyaluronan, triclosan (în geluri, sprayuri,
ape de gură, paste de dinţi, gume de
mestecat)
Tratamentul local cu antibiotice
• apare rapid rezistenţa;
• are mai puţine reacţii adverse decât
terapia sistemică;
• complianţa este bună;
• mai scumpă decât terapia sistemică;
• Tratamentul cu antibiotice nu înlocuieşte
tratamentul mecanic stomatologic.
• Combinarea tratamentului mecanic cu
antibioterapia sistemică sau locală dă
rezultate statistic mai bune decât fiecare
din ele luate separat.