Transcript Farmacoresistenza Gefitinib e Erlotinib

IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO
Leu858Arg del GENE EGFR
(Farmacoresistenza Gefitinib e Erlotinib)
AMPLI-set-Leu858Arg EGFR RT
Cat. n.
2.003RT
EGFR (epidermal growth factor receptor) è un recettore di membrana tirosina chinasico appartenente alla famiglia dei recettori
ErbB. Questo recettore, una volta legato il suo specifico ligando EGF (epidermal growth factor) e TGFα (transforming growth factor
α), attiva molteplici vie di trasduzione del segnale che regolano vari processi cellulari: divisione, apoptosi, motilità, adesione.
Mutazioni dell’EGFR sono implicate in circa il 30% di tutti i tumori epiteliali. Circa il 90% delle mutazioni di EGFR comprendono
una sostituzione di leucina con arginina in posizione 858 (L858R) e una delezione nell’esone 19, che influenza la sequenza
conservata LREA (delE746-A750). Queste mutazioni causano un’attivazione costitutiva della porzione tirosinchinasica di EGFR,
destabilizzando la sua conformazione autoinibente, normalmente mantenuta in assenza di ligando; queste mutazioni attivanti
conferiscono ipersensibilità agli inibitori tirosinchinasici gefitinib e erlotinib. Diversi studi retrospettivi hanno evidenziato come le
mutazioni di EGFR siano un fattore predittivo indipendente di risposta, overall survival (OS) e progression-free survival (PFS) in
pazienti con tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC) trattati con gefitinib, la maggior parte dei quali sottoposti a
precedente chemioterapia.
Il kit permette l’identificazione del polimorfismo Leu858Arg, mediante la tecnica della Real-time PCR. La ricerca di tale
polimorfismo viene eseguita previa amplificazione con primers specifici ed ibridazione con un probe che riconosce una sequenza
interna.
Nel kit utilizzato per la rivelazione del polimorfismo Leu858Arg, il probe che riconosce la sequenza wt (allele T) è coniugata al
reporter FAM, mentre quello che riconosce la sequenza polimorfica (allele G) è coniugato al reporter JOE.
Principio del metodo:
A) estrazione del DNA genomico
B) amplificazione e rivelazione mediante l’utilizzo
dell’apparecchio real-time PCR.
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato da
sangue intero e da campioni di tessuto fresco e in paraffina.
Numero di Test: 50.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
AMPLIFICAZIONE
PCR mix 2X
H2O sterile
Primer-probe mix 20X
Controllo positivo normale (TT)
Controllo positivo omoz. Mutato (GG)
Controllo positivo Eterozigote (TG)
+4°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato.
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; portaprovette refrigerato;
puntali sterili con barriera antiaerosol; piastra da 96 pozzetti.
Reagenti richiesti non compresi nel kit: acqua bidistillata
sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.
Per l'estrazione del DNA si consiglia di utilizzare i seguenti
kit:

Kit Estrazione DNA da Sangue intero - cat. n. 101

Kit Estrazione DNA da tessuto in paraffina –
cat.n.103
Strumenti richiesti:
Centrifuga con rotore ad angolo fisso per provette da 2 ml
(12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per
provette da 15 ml (1.500 x g);
Set di pipette pre-PCR e post-PCR
1) 0.5 – 20 l
2) 20 – 200 l
3) 200 – 1000 l
Cappa Biohazard classe II; strumentazione real-time PCR.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono
essere sterili, DNase/RNase free e monouso.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
L’analisi dei risultati sarà effettuata dal programma specifico
(ALLELIC DISCRIMINATION) dello strumento Real-time
PCR precedentemente impostato. In ogni caso, comunque,
risulta utile analizzare anche i grafici dell’AMPLIFICATION
PLOT, per accertarsi che la reazione sia avvenuta in modo
corretto.
Allelic discrimination EGFR Leu858Arg
Legenda:
Rosso: Allele WT (T)
Verde: Alleli T e G
Blu: Allele MUT (G)
Amplification plots EGFR Leu858Arg
Legenda: Blu: Allele WT (T) Fuxia: Allele Mut (G)
Bibliografia
Science (2004) 304, 1497-1500.
N Engl J Med (2004) 350, 2129-2139.
Proc Natl Acad Sci U S A (2004) 101, 13306-13311.
L Clin Oncol (2005), 23:2513-2520.
Rev.01