Transcript (delE746-A750) del GENE EGFR

IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO
ELREA (delE746-A750) del GENE EGFR
(Farmacoresistenza Gefitinib)
AMPLI-set-ELREA EGFR
Cat. n. 2.002
EGFR (epidermal growth factor receptor) è un recettore di membrana tirosina chinasico appartenente alla famiglia dei
recettori ErbB. Questo recettore, una volta legato il suo specifico ligando EGF (epidermal growth factor) e TGFα
(transforming growth factor α), attiva molteplici vie di trasduzione del segnale che regolano vari processi cellulari:
divisione, apoptosi, motilità, adesione.
Mutazioni dell’EGFR sono implicate in circa il 30% di tutti i tumori epiteliali. Circa il 90% delle mutazioni di EGFR
comprendono una sostituzione di leucina con arginina in posizione 858 (L858R) nell’esone 21, e una delezione di 5
amminoacidi nell’esone 19 che influenza la sequenza conservata ELREA (delE746-A750). Queste mutazioni causano
un’attivazione costitutiva della porzione tirosinchinasica di EGFR, destabilizzando la sua conformazione autoinibente,
normalmente mantenuta in assenza di ligando; queste mutazioni attivanti conferiscono ipersensibilità agli inibitori
tirosinchinasici gefitinib e erlotinib. Diversi studi retrospettivi hanno evidenziato come le mutazioni di EGFR siano un
fattore predittivo indipendente di risposta, overall survival (OS) e progression-free survival (PFS) in pazienti con
tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC) trattati con gefitinib, la maggior parte dei quali sottoposti a
precedente chemioterapia.
Il kit permette l’identificazione del polimorfismo LREA (delE746-A750) mediante l’uso della PCR (Polymerase Chain
Reaction).
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Principio del metodo:
a) estrazione del DNA genomico;
b) amplificazione;
c) rivelazione sul gel di agarosio.
Applicabilità: su DNA genomico estratto e purificato da
campioni di sangue intero, tessuto fresco e in paraffina.
Numero di test: 24.
Il test determina la presenza o meno della mutazione
delE746-A750. In particolare l’amplificazione del campione
wt corrisponde ad un frammento di 90 bp. Il frammento
amplificato dal campione mutato è di 75 bp. Il campione
eterozigote presenta l’amplificazione di entrambi i frammenti
ben distinguibili dopo una corsa elettroforetica su un gel al 34% di agarosio.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
AMPLIFICAZIONE
Mix PCR delELREA
H2O DNase/RNase-free
Taq Polymerase (5U/l)
Controllo DNA
Legenda:
Lanes 1,2,3: Campione
WT (assenza di
delezione)
Lane 4: Campione
eterozigote (presenza di
un allele con delezione)
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato.
Materiali richiesti: provette da 1,5 ml e da 15 ml in
polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con
barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteur di vetro);
provette da PCR.
Reagenti richiesti non compresi nel kit: acqua bidistillata
sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.
Per l'estrazione del DNA e l'elettroforesi su gel di agarosio si
consiglia di utilizzare i seguenti kit:

Kit Estrazione DNA da Sangue intero- cat. n. 101

Kit Estrazione DNA da tessuto in paraffina –
cat.n.103

Kit di Rivelazione - cat. n. 201
Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo fisso
per provette da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore
oscillante con adattatori per provette da 15 ml (1.500 x g);
Set di pipette pre-PCR e post-PCR (0.5 – 20 l, 10 – 100 l,
20 – 200 l, 200 – 1000 l); termociclatore programmabile;
cappa Biohazard classe II; camera elettroforetica con
alimentatore; transilluminatore UV; apparato fotografico.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono
essere sterili, DNase/RNase free e monouso.
Amplificato in bp
wild type
eterozigote
Omozigote
mutato
90
90
75
75
Bibliografia
Science (2004) 304, 1497-1500.
N Engl J Med (2004) 350, 2129-2139.
Proc Natl Acad Sci U S A (2004) 101, 13306-13311.
L Clin Oncol (2005), 23:2513-2520.
Rev.01