Transcript AdnaTest ProstateCancerSelect

Versione 160331 IT
AdnaTest
ProstateCancerSelect
Arricchimento di cellule tumorali dal sangue di pazienti con
tumore della prostata per l’analisi dell’espressione genica
Per uso diagnostico in vitro
Manuale
T-1-520
Indice generale
Informazioni per gli ordini ......................................................... 3
Scopo previsto ......................................................................... 3
Abbreviazioni e simboli ............................................................ 4
Brevetti e marchi registrati ....................................................... 4
Descrizione del prodotto .......................................................... 5
Componenti del kit ................................................................... 6
Ulteriori materiali necessari ...................................................... 7
Conservazione ......................................................................... 8
Informazioni per l’uso ............................................................... 8
Avvertenze e precauzioni per l’uso diagnostico in vitro .........10
Protocollo ...............................................................................11
A. Preparazione delle Biglie ProstateSelect .......................11
B. Selezione delle cellule tumorali ......................................12
Caratteristiche prestazionali ...................................................14
Manuale breve .......................................................................15
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AdnaTest ProstateCancerSelect
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Informazioni per gli ordini
Le informazioni per gli ordini sono disponibili su www.qiagen.com e
www.adnagen.com.
Inoltre il team di supporto di QIAGEN Hannover è a disposizione
per rispondere a qualsiasi domanda riguardante i kit AdnaTest
([email protected]).
Scopo previsto
Il kit AdnaTest ProstateCancerSelect è stato sviluppato per
l’arricchimento delle cellule tumorali circolanti (CTC) dal sangue
periferico di pazienti con tumore della prostata ed è destinato all’uso
diagnostico in vitro.
Il kit AdnaTest ProstateCancerDetect è consigliato per la successiva
analisi dell’espressione genica associata al tumore della prostata.
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Abbreviazioni e simboli
AdnaMag-L
Concentratore di particelle magnetiche
(L = large, grande)
AdnaMag-S
Concentratore di particelle magnetiche
(S = small, piccolo)
bp
Coppie di basi
cDNA
Acido deossiribonucleico complementare
DNA
Acido deossiribonucleico
mRNA
Acido ribonucleico messaggero
PCR
Reazione a catena della polimerasi
RNasi
Ribonucleasi
rpm
Giri al minuto
RT
Trascrizione inversa
Utilizzare entro la data indicata
Limite di temperatura
Numero di catalogo
Fare riferimento alle informazioni fornite nel manuale
Produttore
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Brevetti e marchi registrati
Dynabeads® è un marchio registrato di Invitrogen and Life
Technologies Corporation.
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AdnaTest ProstateCancerSelect
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Descrizione del prodotto
Il kit AdnaTest ProstateCancerSelect consente l’arricchimento
immunomagnetico delle cellule tumorali tramite antigeni epiteliali e
associati al tumore. Gli anticorpi contro gli antigeni epiteliali e
associati al tumore vengono coniugati con le biglie magnetiche
(Dynabeads®) per marcare le cellule tumorali nel sangue periferico.
Le cellule marcate vengono estratte da un concentratore di
particelle magnetiche (AdnaMag-L e AdnaMag-S) e successivamente vengono sottoposte a lisi (Figura 1).
Il lisato cellulare è utilizzato per eseguire ulteriori analisi (si consiglia
di proseguire con il kit AdnaTest ProstateCancerDetect).
Biglie
ProstateSelect
Incubazione
Separazione
Lisi cellulare
RNA
AdnaTest ProstateCancerSelect
Purificazione
dell’mRNA con biglie
magnetiche rivestite
di Oligo(dT)25
RNA
Cellule ematiche
Trascrizione
inversa
RNA
Cellule tumorali
cDNA
Biglie magnetiche
rivestite di
anticorpi o
Oligo(dT)25
AdnaTest ProstateCancerDetect
Figura 1. Schema della preparazione dei campioni
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Componenti del kit
Il kit AdnaTest ProstateCancerSelect include i componenti seguenti:
Tabella 1. Componenti del kit
Componente
ProstateSelect Beads
(Biglie ProstateSelect)
Lysis/Binding Buffer
(Tampone di legame/lisi)
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Simbolo
T-1-520
(12 test)
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AdnaTest ProstateCancerSelect
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Ulteriori materiali necessari
Attrezzatura:
• Rotatore per provette da 15 ml e 1,5 ml
• Concentratori di particelle magnetiche
AdnaMag-L (QIAGEN Hannover GmbH, n. cat. T-1-700)
AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, n. cat. T-1-800)
Materiale:
• Pipette di plastica o vetro da 10 ml sterili, prive di RNasi
e pipettatore
• Provette di reazione da 1,5 ml, sterili, prive di RNasi
(ad es. Sarstedt, n. cat. 72.690)
• Provette da 15 ml (utilizzare provette in polipropilene sterili,
prive di RNasi, ad es. Sarstedt, n. cat. 65.554.502)
• Pipette e puntali privi di RNasi, provvisti di barriera antiaerosol,
idonei per pipettare volumi tra 100 µl e 1000 µl
• Guanti e occhiali di protezione
Reagenti:
• Tampone fosfato salino (PBS), pH 7,0-7,3 (ad es. Fisher,
n. cat. VX14190169, D-PBS)
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Conservazione
Il kit AdnaTest ProstateCancerSelect deve essere conservato a
4-8°C. Non utilizzare nessun componente oltre la data di scadenza.
Informazioni per l’uso
Nel caso la confezione esterna o i singoli componenti del kit
appaiano danneggiati, contattare il supporto tecnico QIAGEN (per le
informazioni sui contatti, visitare www.qiagen.com).
Il test deve essere eseguito da personale competente nelle tecniche
di biologica molecolare.
Preparazione del campione:
• I campioni di sangue devono essere prelevati prima
dell’assunzione di sostanze terapeutiche. Non utilizzare il kit
AdnaTest se non sono trascorsi 7 giorni dall’ultimo intervento
terapeutico!
• Prelievo del sangue: utilizzare soltanto provette per prelievo
ematico AdnaCollect (n. cat. T-1-600, QIAGEN Hannover GmbH)
o provette per prelievo ematico contenenti l’anticoagulante EDTA
(ad es. “S Monovette® Kalium EDTA”, Sarstedt; “BD Vacutainer®
K3EDTA”, Becton Dickinson), prelevando almeno 5 ml di sangue
intero. Non utilizzare eparina o citrato.
• Conservare immediatamente il sangue a 4-8°C.
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AdnaTest ProstateCancerSelect
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• I campioni devono essere trattati il prima possibile e
comunque entro 4 ore dal prelievo del sangue se si utilizzano
provette con EDTA oppure entro 24 ore se si utilizzano
provette AdnaCollect.
• Il campione di sangue non deve essere emolizzato.
Manipolazione:
• Le Biglie ProstateSelect 1 contengono azoturo di sodio come
conservante. L’azoturo di sodio è citotossico, pertanto deve
essere rimosso prima di utilizzare le biglie.
• Tutti i componenti e i reagenti supplementari procurati da altri
fornitori devono essere conservati secondo le rispettive istruzioni.
Sono valide le indicazioni sulla sicurezza fornite dai rispettivi
produttori.
• Indossare guanti di protezione per evitare la contaminazione con
DNA, RNA e RNasi.
• Aliquotare le Biglie ProstateSelect per evitare la contaminazione.
Il test deve essere eseguito nella sequenza descritta e deve
essere conforme a tutte le specifiche dichiarate rispetto a
tempi e temperature di incubazione.
• Scartare i campioni in caso di agglutinazione delle biglie durante
l’arricchimento cellulare.
• Le procedure di trattamento dei campioni, tra cui la trascrizione
inversa e la successiva analisi dei prodotti della PCR amplificati,
devono essere eseguite preferibilmente in stanze diverse per
evitare contaminazioni crociate.
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• L’uso di prodotti di fornitori diversi da quelli consigliati può
causare risultati di qualità inferiore.
Avvertenze e precauzioni per l’uso diagnostico in vitro
Durante la manipolazione di sostanze chimiche, è opportuno
indossare sempre un camice da laboratorio, guanti monouso e
occhiali protettivi. Per maggiori informazioni, consultare le schede di
sicurezza sul prodotto (SDS). Le schede sono disponibili online nel
pratico formato PDF sul sito www.qiagen.com/safety, dove è
possibile cercare, visualizzare e stampare la scheda SDS di ogni kit
e di ogni componente del kit QIAGEN.
Smaltire campioni e materiali di scarto nel rispetto delle procedure
di sicurezza locali.
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Protocollo
A. Preparazione delle Biglie ProstateSelect
È necessario rimuovere l’azoturo di sodio lavando le Biglie
ProstateSelect prima dell’uso:
1.
Risospendere le Biglie ProstateSelect 1 pipettando con cura;
non agitare in vortex!
2.
Calcolare il volume delle Biglie ProstateSelect 1 necessarie
per tutti i campioni da trattare (100 µl per campione) e trasferire
il volume calcolato in una provetta di reazione da 1,5 ml.
Se vengono trattati più di 10 campioni, utilizzare altre provette
di reazione da 1,5 ml.
3.
Posizionare la provetta nell’AdnaMag-S.
4.
Dopo 1 minuto, rimuovere il sopranatante con una pipetta.
Importante per ogni procedura:
non toccare le biglie durante la rimozione dei sopranatanti!
5.
Lavaggio
a. Rimuovere la guida magnetica dall’AdnaMag-S.
b. Aggiungere 1 ml di tampone PBS e risospendere le biglie
con pipettamenti ripetuti.
c. Posizionare la guida magnetica nell’AdnaMag-S.
d. Dopo 1 minuto, rimuovere tutto il sopranatante con una
pipetta.
Ripetere due volte (tre lavaggi in totale).
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6.
Rimuovere la provetta dall’AdnaMag-S e risospendere le biglie
nel tampone PBS fino al volume originale (100 µl per
campione).
B. Selezione delle cellule tumorali
1.
Pipettare 5 ml di un campione di sangue in una provetta da
15 ml (utilizzare soltanto le provette per prelievo ematico
approvate; vedere pagina 8).
2.
Risospendere con cura le Biglie ProstateSelect (preparate al
passaggio A6) pipettandole e aggiungendone 100 µl in ogni
campione di sangue.
3.
Ruotare le provette lentamente (circa 5 rpm) per 30 minuti a
temperatura ambiente su un dispositivo che esegue movimenti
rotatori e basculanti.
4.
Posizionare le provette nell’AdnaMag-L senza la guida
magnetica. Fare oscillare l’AdnaMag-L verso il basso per
liberare le gocce di sangue catturate nel tappo.
5.
Inserire la guida magnetica e incubare le
nell’AdnaMag-L per 3 minuti a temperatura ambiente.
6.
Nel frattempo equilibrare il Tampone di legame/lisi 2 a
provette
temperatura ambiente.
Nota: verificare che il Tampone di legame/lisi non contenga precipitati. In
presenza di un precipitato, equilibrare il tampone a temperatura
ambiente e miscelarlo fino al completo scioglimento.
7.
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Rimuovere tutto il sopranatante ematico con una pipetta da
10 ml, senza toccare le biglie.
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8.
Lavaggio
a.
b.
Rimuovere la guida magnetica dall’AdnaMag-L.
Aggiungere 5 ml di tampone PBS, chiudere le provette e
agitare delicatamente l’AdnaMag-L in avanti e indietro per
5 volte, in modo da risospendere i complessi biglia
magnetica/cellula.
c. Fare oscillare l’AdnaMag-L con le provette verso il basso
per due volte, in modo da liberare le gocce catturate nel
tappo.
d. Posizionare la guida magnetica nell’AdnaMag-L e incubare
per 1 minuto a temperatura ambiente.
e. Rimuovere tutto il sopranatante con una pipetta.
Ripetere due volte (tre lavaggi in totale).
9.
Rimuovere la guida magnetica dall’AdnaMag-L.
10. Risospendere i complessi biglia magnetica/cellula in 1 ml di
tampone PBS e trasferire ogni campione in una provetta di
reazione da 1,5 ml.
11. Posizionare le provette di reazione nell’AdnaMag-S con una
guida magnetica inserita.
Nota: la guida magnetica dell’AdnaMag-S può essere inserita in due
posizioni. Inserire sempre la guida con la pellicola di plastica bianca
rivolta in avanti per assicurare che i magneti siano vicini alle provette di
reazione.
12. Dopo 1 minuto, rimuovere i sopranatanti completamente con
una pipetta per ottimizzare la lisi cellulare successiva!
13. Rimuovere la guida magnetica dall’AdnaMag-S.
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14. Aggiungere 200 µl di Tampone di legame/lisi 2 (equilibrato a
temperatura ambiente) in ogni provetta
Risospendere pipettando almeno cinque volte.
di
reazione.
15. Inserire la guida magnetica nell’AdnaMag-S e incubare per
1 minuto.
16. Trasferire i sopranatanti (lisati cellulari) in nuove provette di
reazione da 1,5 ml.
17. Scartare le provette con le biglie.
18. Proseguire immediatamente con l’estrazione dell’mRNA
(AdnaTest ProstateCancerDetect) o conservare i lisati cellulari
a non più di -20°C per 2 settimane al massimo.
Caratteristiche prestazionali
Per le caratteristiche prestazionali del kit AdnaTest ProstateCancerSelect, vedere www.qiagen.com/HB-2100-D01.
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Manuale breve
AdnaTest ProstateCancerSelect
Componenti
Occorrente per
ogni campione
ProstateSelect Beads
(Biglie ProstateSelect)
Lysis/Binding Buffer
(Tampone di legame/lisi)
1
2
• 5 ml di sangue intero (per i dettagli,
vedere pagina 8)
• 1× provetta da 15 ml
• 2× provette di reazione da 1,5 ml
• Pipette di plastica o vetro da 10 ml
(prive di RNasi) e pipettatore
• Pipette da 100-1000 µl e puntali
(privi di RNasi)
Protocollo
• Risospendere con cura le Biglie ProstateSelect 1 e trasferirne
100 µl per ogni campione di sangue in una provetta di reazione
da 1,5 ml.
• Lavare le Biglie ProstateSelect con 3 × 1 ml di tampone PBS.
• Risospendere le Biglie ProstateSelect in 100 µl di tampone PBS
per campione di sangue.
• Trasferire 5 ml di sangue intero in una provetta da 15 ml.
• Aggiungere 100 µl di Biglie ProstateSelect lavate in ogni
campione di sangue.
• Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con movimenti
rotatori e basculanti a circa 5 rpm.
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• Posizionare la provetta nell’AdnaMag-L per 3 minuti per separare
le biglie. Liberare tutte le gocce di sangue catturate nel tappo
facendo oscillare l’AdnaMag-L verso il basso.
• Rimuovere il sopranatante ematico.
• Lavare le biglie con 3 × 5 ml di tampone PBS.
• Risospendere le biglie in 1 ml di tampone PBS e trasferirle in una
provetta di reazione da 1,5 ml.
• Separare le biglie nell’AdnaMag-S e rimuovere il sopranatante.
• Risospendere le biglie in 200 µl di Tampone di legame/lisi 2
pipettando almeno cinque volte.
• Posizionare le provette di reazione nell’AdnaMag-S e trasferire il
sopranatante in una nuova provetta di reazione.
Proseguire immediatamente con il kit AdnaTest ProstateCancerDetect o conservare a non più di -20°C per 2 settimane
al massimo.
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QIAGEN GmbH
QIAGEN Strasse 1
D-40724 Hilden
GERMANIA
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+49 (0) 511 72 59 50 - 50
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E-mail:
[email protected]
Internet:
www.adnagen.com e www.qiagen.com