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Presentazione del progetto
"FORTORE AGAINST CANCER“
Sabato 30 giugno
Complesso monumentale di S. Giovanni
Eremita Foiano V.F. (BN)
Farmacogenomica e
Farmacogenetica
L’importanza di predire l’efficacia di una terapia Antitumorale
Medicina predittiva e terapia personalizzata
Il farmaco giusto alla dose giusta
per il paziente giusto
In collaborazione con la “Italian
Association of Pharmacogenomics and
Molecular Diagnostics”
Farmacogenomica
Farmacogenetica
definizioni


Farmacogenetica: lo studio della variabilità di
risposta a un farmaco dovuta a fattori genetici, nei
singoli individui (idiosincrasia) o in diverse etnie. La
recente rivoluzione genomica ha portato all'evoluzione
del concetto di farmacogenetica in farmacogenomica.
Farmacogenomica: include studi su variazioni nel
DNA germinale, incluse le mutazioni puntiformi aquisite
del DNA e variazioni nell'espressione di RNA di alcuni
geni, prodotte dall’uso di particolari farmaci. Pertanto
viene inclusa nella definizione anche il meccanismo
genetico che provoca un eventuale sovradosaggio
(Farmaco-tossicologia) o inefficacia del medicinale
(Farmaco-resistenza), e le metodologie tecnologiche
per rilevarlo.
Variante GENICA
Risposta
Farmacologica
Farmacogenomica
Farmacogenetica
Il farmaco giusto alla dose giusta
per il paziente giusto
La variabilità individuale nelle
risposte ai farmaci è dovuta a
fattori:
• Fisiologici
– età, sesso, peso corporeo
• Patologici
– malattie, livello di funzionalità epatica o
renale
• Ambientali
– dieta, alcool, tabacco, altri farmaci
• Genetici
– Polimorfismi, mutazioni acquisite ecc,
Proteine chimeriche
Costitutivamente
attivate
Attivazione di
Oncogeni
Perdita della funzionalità
di Oncosoppressori
iperespressione genica
Iperproliferazione
clonale
Mutazioni NON puntiformi
E Polimorfismi
Polimorfismi che influenzano
l’efficacia di un Farmaco
Sostituzione di un singolo paio
di basi (SNP) nella
sequenza di DNA
1 SNP ogni 1000 basi
10 milioni nel genoma umano
(1.5 milioni confermati)
5-10 SNPs per gene
1% possono avere significato
biologico (SNPs nelle
regioni codificante o
regolatrici)
Si
definiscono polimorfici tutti quegli alleli (o loci) che accomunano almeno l’1% di una etnia
Geni che influenzano la risposta al
farmaco
MDR-1,
hOCT-1
Cyt-P450
family;
MTHFr
ecc
C-ABL; cKit; B-RAF
Multiple factors contributing to variations in drug responses
MUTATION
Molecular effect
(codons)
Drug
Effect on therapy/reference
Decresed enzyme
activity
Cyclophosfamide
Etoposide
paclitaxel
Interindividual variability in
Pharmacokinetics (1)
various
Rapid degradation
6-MP
Thioguanine
Hematopoietic toxicity (10)
UGT1A 28
TA repeats in 5’
promoter
Low expression
Irinotecan
Neutropenia toxicity (20)
TYMS
3 tandem repeats
High expression
5-FU, MTX
Drug resistence (54)
B-RAF
V600E
Costitutive signal
activation
Vemurafenib
Drug resistence (72)
MTHFR
(C677T)
Decresed enzyme
activity
MTX
Toxicity (77 toffoli)
c-KIT
(T1982C)
(T81421A)
Costitutive signal
activation
Imatinib
desenzitizes activity in GIST
EGFR
HER2
overexpression
trastuzumab
EGFR
L858R
Gefitinib
Erlotinib
Good response (58 )
ABL
T(9;22)
Imatinib
Dasatinib
Nilotinib
Good response in LMC
ABL
T315I
M351T
Imatinib
Drug resistence
RARa
T(15;17)
Retinoic acid
Good response in AML-M3
GENE
(nucleotide translation)
Cytocrome P450
family
various
TPMT2, 3A, 3C
Costitutive signal
activation
Test raccomandati dalla FDA: Le maggiori anomalie genomiche che
interferiscono nella chemioterapia antineoplastica
Farmacogenomica
dalla ricerca di base alla pratica clinica
How and why, translating a
pharmacogenomics (PGx)
Test into clinical practice
FDA’s guidance on
Pharmacogenomics
studies
Indagini molecolari di Farmacogenomica
eseguibili nell’ambito del Progetto
“Fortore Against Cancer”
Indagine
diagnostica
Analisi
( su DNA)
B-RAF V600E
Mutazione
CYP29C9*2/*3
430C/T
1075A/C
MDR 1
Polimorfismo
CitocromoP
Mutazioni c-Kit
Exon 11 e 17
Mutazioni ABL
Exon 5-10
Mutazioni JAK1
JH1,2 domain
JAK2 exon 12
DPYD
TYMS
Tipo di
prelievo
#
Biopsia
Sangue P
Sangue P
Metodologia
Tossicità (T) o Resistenza
(R)
PCR+
digestione (1)
PCR+
digestione (1)
La mutazione è suscettibile al
Vemurafenib nei melanomi
Multidrug
Resistance 1
Mutazione
codon D560 e
D860
Gene di
fusione BCRABL
Geni Janus
Kinase 1 e 2
Sangue P
PCR+
digestione (1)
PCR+
sequenza (3)
Suscettibilità ad imatinib nei
GIST
Sangue P
PCR+
sequenza (3)
Resistenza ad imatinib e
derivati nelle LMC
Sangue P
PCR+
sequenza (3)
Suscettibilità a Ruxolitinib in
Sindromi Mieoloproliferative
Polimorfismo
Sangue P
PCR+
sequenza (3)
Tossicità dopo
somministrazione di 5Fluorouracile
Biopsia
Sangue P
Tossicità alla terapia
antineoplastica con Etoposide
ed anticoagulante con
Warfarin
Identificazione della mutazione B-RAF nei
melanomi e carcinomi papilliferi tiroidei
Nuovo Farmaco ultraselettivo diretto contro il B-RAF Mutato
STEP1
Step 2
Step 3
•Disegno del test B-RAF
basato su metodica di
Biologia Molecolare
(PNA mediated
clamping-PCR)
•Validazione analitica
del test
•Deposito del Brevetto
presso la camera di
commercio di
Benevento
Raccolte e devolute alla LILT € 625,00
Pharmacogenomics Methods
PNA Mediated clamping-PCR
Wild type NO MISMATCH: HIGH AFFINITY PNA . PCR BLOCKED
TEMPERATURE
(°C)
MUTANT MISMATCH: LOW AFFINITY PNA. PCR SYNTHESIS
DENATURATION
EXTENSION AND PNA CLAMPING
PNA ANNEALING
M WT
+ -
PRIMERS ANNEALING
TIME
PCR CYCLE (CT)
From Di Francia R et al Clin Chem Lab Med 2010; (3): 348-57
Pharmacogenomics Methods
PNA Mediated clamping-PCR
Caratteristiche del nuovo test B-RAF V600E:
Elevata sensibilità analitica: 1 cellula mutata/10000 wt .
Elevata specificità: il blocco della PCR delle sequenze di
DNA wt avviene attraverso l’elevata avidità di legame
dell’oligo-PNA
 Test di facile esecuzione: non ha bisogno di personale
ultraspecializzato (semplice reazione di PCR)
 Test economico: non ha bisogno di strumentazione
tecnologicamente avanzata
 Uso del test NON richiama conflitti di interesse
commerciali: il proprietario del brevetto è la IAPharmagen
(associazione No Profit), che ha utilizzato in parte risorse
derivanti da donazione dell’evento “tutti in campo contro il
cancro” Edizione 2011 in Foiano Val Fortore.



CYP2D6
◦ 25% of prescribed drugs

CYP2C19
◦ Diazepam, imipramine
(antidepressants)
◦ Omeprazole (gastric
ulcers)

CYP2C9
◦ Phenytoin (antiepileptic)
◦ Warfarin (anticoagulant)
◦ Glipizide
(hypoglycemic/diabetes)
LA FAMIGLIA DI ENZIMI METABOLICI di Fase I
DEL CITOCROMO P450
GST (Glutathione S-Tranfertase)
 oxaliplatinum


NAT2 (N-acetyltransferase)
◦ Tobacco carcinogens (cancer risk)
◦ Sulfonamides (bacterial infections)
◦ Caffeine

UDP Glucorosil-Transferase
◦ Irinotecan

TMPT (thiopurine
methyltransferase)
◦ Anticancer drugs to treat acute
lymhoblastic leukemia)
LA FAMIGLIA DI ENZIMI METABOLICI di Fase II
Leucemia Mieloide
Cronica
Citogenetica
Terapia
*98%
87%
Dati Laboratorio
a)
b)
Aumento WBC
Aumento LAP
Morfologia su striscio di SP o AM
70%
*Risposta completa
Farmacogenomica
Farmacogenetica
IMATINIB
La Farmacogenomica nelle
Mielodisplasie e policitemie
Ruxolitinib
Inibitore delle
Tirosin Kinase
Dei geni JAK1 e 2
Jak1 and Jak2 Mutations
Tecnologie e metodi usati per gli studi di
farmacogenomica e Farmacogenetica
Methods for new mutations detection
Screening methods
High resolution melting
dHPLC
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
Single strand conformation polymorphism (SSCP)
Detection methods
Conventional sequencing and High Throughput sequencing
Methods for known mutations detection
Low throughput
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Allele Specific Amplification (AS-PCR)
Peptide nucleic acid- mediated Clamping PCR
Medium throughput
Pyrosequencing
Oligo ligation assay (SNPlex)
TaqMan Allelic Discrimination Assay (FRET technologies)
Scorpions probe
Invader Assay
Maldi-TOF Mass Spectroscopy
Golden Gate Assay
High throughput
Gene Chip technology
From Di Francia R et al Clin Chem Lab Med 2010; (3): 348-57
Farmacogenomica
Farmacogenetica
Implicazioni Bioetiche
Pharmacogenomics test
Will allow a taylored medicine
Insert your
Saliva sample
Insert coin
Please take
Away your
medicine
Aknowledgements
Centro Ricerche e Laboratorio Analisi