Transcript dott.ssa n.vicari

Roma, 1 ottobre 2014
Metodi Molecolari
per la Ricerca,
Identificazione e tipizzazione
di Francisella tularensis
Nadia Vicari
IZSLER – Sezione di Pavia
Metodi molecolari
• Rilevare
• Identificare
• Tipizzare
• Sub-tipizzare
1
Tecniche utilizzate
• Rilevare
PCR end-point
• Identificare
• Tipizzare
• Sub-tipizzare
PCR real-time
MLVA
Whole genome seq
Classificazione di Francisella tularensis
Taxon
Famiglia
Genere
Specie
1
Francisellaceae
Francisella
1.
2.
3.
4.
5.
F. tularensis
F. novicida
F. philomiragia
F. noatunenisis
F. hispaninensis (2010)
Classificazione di Francisella tularensis
Taxon
Famiglia
Genere
Specie
Francisellaceae
Francisella
1.
2.
3.
4.
5.
F. tularensis
F. novicida
F. philomiragia
F. noatunenisis
F. hispaninensis
Classificazione di Francisella tularensis
l’ identità tassonomica …
Identificazione a livello di genere e specie,
secondo un approccio basato su valutazioni
fenotipiche, biochimiche e genomiche
6
1
Caratteristiche biochimiche e fenotipiche
WHO Guidelines on Tularemia - 2007
Albero filogenetico basato sulla sequenza del gene 16S rDNA
Albero filogenetico basato sulle sequenze depositate in GenBank del gene 16S rDNA del genere Francisella
e di altri batteri rappresentativi della classe gamma proteobatteri
Titball R.W. et al. 2003 TRENDS in Microbiology 11: 118-123
1
Sottospecie di Francisella tularensis
F. tularensis
F. tularensis
tularensis
F. tularensis
holarctica
(tipo A)
(tipo B)
F. tularensis
mediasiatica
F. tularensis
novicida
L’identità nucleotidica media
osservata confrontando i
genomi è ≥ 97,7%
Kingry. et al. 2014 Cell Inf Microbiol 4: 1-12
Materiale di partenza
MILZA, FEGATO, RENE,
ZECCHE,
ACQUA
ISOLATI BATTERICI
BIOPSIE
1
Iter analitico
Matrice-DNA
PCR
screening
POS
PCR
identificazione
NEG
NO
Francisella spp.
NEG
Francisella
philomiragia
POS
PCR tipizzazione
F. tul. tularensis, F. tul. holarctica,
F. tul. mediasiatica, F. novicida
Geni target
•
rilevare la presenza di Francisella spp.
•
identificare Francisella tularensis
•
tipizzare Francisella tularensis
gene target
tul4
17 kDa Lipoprotein
ISFtu2
Insertion Sequence Element
23kDa
1
protein expressed upon macrophage infection
fopA
Outer membrane protein
16S rDNA
16S rRNA
RD1
genomic Region of Difference
Rilevare la presenza di Francisella spp.
PCR di screening
M 1 2
3 4 5 C-
gene target:16S rDNA
715pb
Matrice
PCR
screening
POS
PCR
identificazione
1.
2.
3.
4.
5.
NEG
NO
Francisella spp.
NEG
Francisella
philomiragia
POS
F. tul. tularensis (A)
F. tul. mediasiatica
F. tul. holarctica (B)
F. novicida
F. philomiragia
6. Francisella-like
F. tul. tularensis, F. tul. holarctica,
F. tul. mediasiatica, F. novicida
PCR tipizzazione
Forsmann. et al. 1994 Int. J. Syst. Bact. 44: 38-46
Identificare Francisella tularensis
PCR di identificazione
M 1 2 3 4
gene target: tul 4
Matrice
POS
PCR
identificazione
POS
PCR tipizzazione
PCR
screening
400pb
NEG
NO
Francisella spp.
NEG
C-
Francisella
philomiragia
1.
2.
3.
4.
F. tul. tularensis (A)
F. tul. mediasiatica
F. tul. holarctica (B)
F. novicida
F. tul. tularensis, F. tul. holarctica,
F. tul. mediasiatica, F. novicida
Sjostedt. et al. 1997 J. Clin. Microbiol. 35: 1045-1048
1
Tipizzare Francisella tularensis
∆ 30 pb
gene target: elicasi
Tipizzare Francisella tularensis
PCR di tipizzazione
gene target: elicasi
tul
B
tul
A
nov
C-
M
500pb
400pb
Matrice
300 pb
200 pb
POS
PCR
identificazione
POS
PCR tipizzazione
PCR
screening
NEG
100 pb
NO
Francisella spp.
NEG
Francisella
philomiragia
F. tul. tularensis, F. tul. holarctica,
F. tul. mediasiatica, F. novicida
1.
2.
3.
4.
F. tul. tularensis (A)
F. tul. mediasiatica
F. tul. holarctica (B)
F. novicida
Johansson et al. 2000 J. Clin. Microbiol 38: 4180-4185
1
Tipizzare Francisella tularensis
Sono state identificate nel genoma di Francisella tularensis
regioni (genomiche) che differiscono tra le diverse sottospecie
o che sono presenti solo in una sottospecie.
genomic regions of difference (RDs)
Al fine diagnostico la più informativa è la regione chiamata RD1
Tipizzare Francisella tularensis
PCR di tipizzazione
M
VI
Ctul B tul A nov
M
XVIII
target: RD1
3322 pb
PCR
tipizzazione
1522 pb
924 pb
M
1522 bp
F. tul
tularensis
3322 bp
F.
novicida
1453 bp
F. tul
mediasiatica
924 bp
F. tul
holarctica
Broekhuijsen M. et al. 2003. J.Clin. Microbiol. 41 (7) 2924-2931
1
Real-time PCR Sonda TaqMan
Identificare Francisella tularensis
PCR di screening/identificazione
gene target: 23 KDa
Matrice
POS
PCR
PCR
screening
NO
Francisella spp.
NEG
identificazione
POS
PCR tipizzazione
NEG
Francisella
philomiragia
F. tul. tularensis, F. tul. holarctica,
F. tul. mediasiatica, F. novicida
Versage. et al. 1997 JCM 41: 5492-5499
1
Identificare Francisella tularensis
PCR di identificazione
gene target: Ftt0523
Matrice
POS
PCR
screening
NO
Francisella spp.
NEG
PCR
NEG
identificazione
Francisella
philomiragia
POS
PCR tipizzazione
F. tul. tularensis, F. tul. holarctica,
F. tul. mediasiatica, F. novicida
Mitchellel et.al. 2010 Mol. Cell Probes 24: 72-76
Tipizzare Francisella tularensis
PCR multiplex di tipizzazione
target: RD1 e RD6
M
M
F. ph
hi nov med tul A
tul B
Huber. et al. 2010. Int. Syst. Evol. Microbiol. 41 (7) 2924-2931
1
Sub-tipizzare Francisella tularensis
M
Keim et al. 2007Ann. N.Y. Acad. Sci. 1105: 30–66
Sub-tipizzare Francisella tularensis
MLVA
Analysis
?
Vogeler et al. 2004J. Bacteriol. 191: 2474-2484
1
MLVA: Loci indagati
Nome
Locus
Motivo ripetuto
Dimensione
Ripetizione (n.basi)
Nr. di
ripetizioni
1
Ft-M3
AATAAGGAT
AACAAAGAC
9
7-18
2
Ft-M4
TTGTT
5
4-5
3
Ft-M6
TTGGTGAACTTTCTTGCTCTT
21
4-7
4
Ft-M10
TTTCTACAAATATCTT
16
1-2
5
Ft-M13
CTCCAGGACCAA
12
1-2
6
Ft-M20
ATTATTTTGATC
12
3-4
7
Ft-M24
ATAAATTATTTATTTTGATTA
21
1-2
Johansson et al. 2004 J. Bacteriol. 186: 5808-5818
Francisella tularensis: tecnica MLVA
Rivitalizzazione dei
ceppi
99
44
76
34
Tul B 11/12/2000
Tul B 20/8/2000
87178/2005
F tul 1993/09
Ref 2003
98 Tul B 1998
Gp 1 - Lepri autoctone
21851/2006
31741-2/2005
5768/2001
Strain 1964
Ref 10/08
Strain 1994
56138/2008
Gp 2 - Acqua E pidemia Toscana
42055/2008
33399/2010
Gp 3 - Lepri Europa dell'Est
291968/2009
Gp 3 - Lepri Europa dell'E st
318595/2009
156096/08
64
CIMKA
80
Bheyieneh
19
295817/2005
7
123418/2011
G p 3 - Lepri Europa dell'Est
10 8660/1995
21 8763/2001
1241-2/2002
96
8689/1995
323744/2009
ATCC 6223
Gp 4 - F. tularensis subsp.
Estrazione DNA
PCR con primers
specifici per ciascun
«locus» considerato (7)
Elettroforesi e
purificazione dei
prodotti di PCR
1
tularensis
0.001
Analisi dei dati
(cluster analysis e filogenesi)
Sequenziamento del
frammento ed analisi
degli elettroferogrammi
MLVA: ceppi indagati
Isolati italiani:
15 da lepre
1 da uomo
2 da acqua
13 isolati + 3 DNA
da lepri importate dall’Est Europa
2 Gamaleya Institute –Mosca
1960 - 2012
MLVA: risultati
33 ceppi ed i 3 DNA sono stati suddivisi in 14 MLVA cluster
Cluster 1:
tutti gli isolati italiani (12 ceppi)
Cluster 2:
2 ceppi isolati da fonte d’acqua in Toscana
Cluster 3:
15 isolati/DNA dell’Europa dell’Est
Cluster 4:
2 ceppi da USSR
Simpson index 0,82 (0,72-0,91 IC 95%)
1
MLVA: risultati
31741-2/2005
6
13
87178/2005
12
F tul 93/09
1
5768/2001
19 51
Strain 1994
Tul B 11/12/00
32
21851/2006
28
35
Ceppi da Lepri italiane
Ref 2003
98
Ref 10/08
Tul B 20/8/00
99
Strain 1964
41
87
42055/2008
51
71
56138/2008
291968-2/2009
44
Ceppi Lepri Europa Est
33399/2010
67
Tul B 1998
Ceppi Epidemia Toscana (acqua)
2
291968-1/2009
295817/2005
74
90
123418/2011
156096/2008
318595/2009
52
8660/1995
1241-2/2002
36
Ceppi Lepri Europa Est
3
8763/2001
Ref. 2003 palearctica
43
8689/1995
323744/2009
Cimka
99
ATTC 6223
2
Bheyieneh
Ceppi Russi
Ceppo ATCC 6223 F.t tipo A
4
Albero filogenetico basato
sui loci Ft-M3, Ft-M6 e Ft-M24
MLVA: risultati
1
MLVA: risultati
accertare la diversa provenienza geografica
verificare se ceppi isolati da fonti diverse (acqua, lepri)
sono tra loro genotipicamente diversi
attuare un sistema di tipizzazione molecolare, utile in
caso di focolai epidemici per indagare la sorgente di
infezione
allestire un database per confrontare i ceppi italiani con
quelli di altri paesi (europei, USA)
CanSNPs analysis: risultati
1
Whole genome sequences: risultati
Whole genome sequences: risultati
1