Transcript Prezentacja 2

PRZYDATNOŚĆ
DIAGNOSTYCZNA
OZNACZANIA NIEBIAŁKOWYCH
ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH
Maciej Śpiewakowski
III rok OAM
NIEBIAŁKOWE ZWIĄZKI AZOTU
 Mocznik
 Kreatynina
 Kwas moczowy
 Amoniak
MOCZNIK
 diamid kwasu węglowego
 syntetyzowany w wątrobie, usuwany głównie przez nerki
 swobodnie dyfunduje przez błony komórkowe
 ok. 40% mocznika przesączonego w kłębuszkach nerkowych ulega resorpcji
zwrotnej, a także może być wydzielany w kanalikach nerkowych
 stanowi ok. 45% azotu pozabiałkowego osocza
 prawidłowe stężenie w surowicy (10-50 mg/dL) – zależy od:
- perfuzji nerek i wielkości diurezy (klirensu wolnej wody)
- wielkości GFR
- szybkości syntezy mocznika – zależy bezpośrednio od podaży białka
w diecie i katabolizmu białkowego
OZNACZANIE MOCZNIKA
 Metoda chemiczna
- oparta na reakcji Fearon’a, w której diacetyl kondensuje z mocznikiem
tworząc barwną (żółtą) pochodną diazynową absorbującą przy 540 nm
- diacetyl jest niestabilny – jest produkowany w środowisku reakcji z
diacetymonoksymu w środowisku kwaśnym
- ma ograniczoną swoistość (cytrulina i alantoina także dają reakcję dodatnią)
- szybko następuje zmniejszenie natężenia barwy
- reakcja przebiega w 100°C – okres ogrzewania zależy od stężenia mocznika
- nie stosuje się do prawa Lamberta-Beera
OZNACZANIE MOCZNIKA
 Metoda enzymatyczna
- metoda pośrednia – wykorzystuje ureazę hydrolizującą mocznik do CO2 i
NH4+, który jest następnie oznaczany podczas reakcji Berthelota lub z
dehydrogenazą glutaminianową (GLDH):
GLDH
NH4+ + α-ketoglutaran + NADH+H+  glutaminian + NAD+ +H2O
[test optyczny prosty - szybkość zmiany absorbancji przy długości fali 340 nm
jest wprost proporcjonalna do stężenia mocznika]
WARTOŚCI REFERENCYJNE MOCZNIKA
Ze względów metodycznych wartością oznaczaną jest azot mocznika: BUN (blood
urea nitrogen). Przelicznik BUN na stężenie mocznika: 0,46 (mg/dL) lub 2,14
(mmol/L).
- zdrowi dorośli: 6-20 mg/dL
- dorośli powyżej 60 roku życia: 8-23 mg/dL
- ciężarne i dzieci – lekko obniżone stężenia w stosunku do zdrowych dorosłych
- nieco wyższe stężenia u mężczyzn niż u kobiet
MOCZNIK
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
 Nieprawidłowe stężenia mocznika
Obniżone stężenie mocznika w surowicy:
- zaburzenia syntezy mocznika (wyłączone 80-95% miąższu wątroby)
- zmniejszona synteza w wątrobie z towarzyszącym zwiększeniem objętości krwi krążącej (przewodnienie)
- stany anaboliczne (stosowanie androgenów)
- dieta niskobiałkowa
Zwiększone stężenie mocznika w surowicy:
- nadprodukcja mocznika (masywny rozpad białek tkankowych lub bogatobiałkowa dieta, resorpcja białek
po krwawieniu do przewodu pokarmowego, steroidoterapia, nadczynność tarczycy)
- zmniejszenie perfuzji nerek
- odwodnienie
- terapia tetracyklinami
MOCZNIK
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
 Wskazania do oznaczania mocznika w surowicy
- różnicowanie przednerkowej i pozanerkowej azotemii (współczynnik
mocznik/kreatynina)
- nasilenie toksemii mocznicowej u chorych z terminalną niewydolnością nerek
- u chorych dializowanych w celu oceny stanu metabolicznego i nasilenia
katabolizmu białkowego
KREATYNINA
 bezwodnik kreatyny
 występuje we krwi i w moczu
 powstaje w organizmie w wyniku nieenzymatycznego rozpadu fosforanu
kreatyny
 jest wydalana z organizmu wraz z moczem (średnio wydala się tak ok.
14-26 mg kreatyniny na kilogram masy ciała)
 stanowi jeden z markerów biochemicznych pozwalającym monitorować
stan nerek
OZNACZANIE KREATYNINY
 Metody chemiczne
Reakcja Jaffego
- kreatynina reaguje z pikrynianem w środowisku alkalicznym tworząc pomarańczowoczerwony związek kompleksowy (490-500 nm)
- mało swoista reakcja
- dodatnią reakcję Jaffego dają: kwas askorbinowy, glukoza, ciała ketonowe (interferują
najsilniej – gł. acetooctan), białka, pirogronian
- interferuje ujemnie bilirubina – dodanie surfaktantu i stosowanie buforów boranowego lub
fosforanowego podczas reakcji, zmniejsza ten wpływ.
 Metody enzymatyczne
WARTOŚCI REFERENCYJNE KREATYNINY
 Zależne od zastosowanej metody; dla metody Jaffego:
- mężczyźni: 0,9-1,3 mg/dL (80-115 mmol/L)
- kobiety: 0,6-1,1 mg/dL (53-97 mmol/L)
 Współczynnik przeliczeniowy z mg/dL na mmol/L: 88,4
 Wydalanie kreatyniny z moczem:
- mężczyźni: 14-26 mg/kg/24 h (124-230 mmol/kg/24 h)
- kobiety: 11-20 mg/kg/24 h (97-177 mmol/kg/24 h)
KREATYNINA
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
 Nieprawidłowe stężenia kreatyniny
Zwiększone stężenie kreatyniny
Przy prawidłowa funkcja nerek:
- odwodnienie
- akromegalia
Przy ostrej niewydolności nerek:
- przednerkowa (wstrząs hipowolemiczny, kardiogenny, septyczny, anafilaktyczny)
- nerkowa (toksyczne/alergiczne działanie leków, środki cieniujące, mioliza, hemoliza, szpiczak, metale
ciężkie, posocznica, rzucawka ciężarnych, choroby układowe, szybko postępujące kłębuszkowe zapalenie
nerek)
- pozanerkowa (zatrzymanie moczu, narkotyki)
Przy przewlekłej niewydolność nerek: kłębuszkowe zapalenie nerek, śródmiąższowe zapalenie nerek,
nefropatia cukrzycowa, nadciśnienie tętnicze, choroby tkanki łącznej, nerka szpiczakowa)
KREATYNINA
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
 Obniżenie stężenia kreatyniny we krwi nie występuje często. Jego
przyczyną może być głodówka, zanik mięśni lub stosowanie
kortykosteroidów. Może wystąpić także podczas ciąży.
 Stosunek stężenia mocznika do kreatyniny w surowicy krwi
(prawidłowo 12 – 20) służy do oceny funkcji nerek; pozwala określić, czy
występują stany kataboliczne, odwodnienie albo czy stosowana jest dieta
wysokobiałkowa.
KWAS MOCZOWY
 główny produkt katabolizmu puryn
- puryny dostarczane z dietą (ok. 300 mg/24 h)
- katabolizm endogennych kwasów nukleinowych
 synteza kwasu moczowego: ok. 400 mg/24 h
 w nerkach kwas moczowy jest:
- filtrowany w kłębuszkach nerkowych
- w 98-100% resorbowany w cewkach proksymalnych krętych
- następnie wydzielany do światła kanalików w części dystalnej
kanalików proksymalnych
- resorbowany w cewkach dystalnych
 6-12% kwasu moczowego przefiltrowanego w kłębuszkach jest wydalone z
moczem.
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO
 Metoda chemiczna
Metoda z kwasem fosforowolframowym (PTA)
- wykorzystuje właściwości redukujące kwasu moczowego
- PTA w środowisku alkalicznym ulega redukcji pod wpływem kwasu
moczowego – powstaje barwny związek (650-700 nm)
- wiele substancji interferuje w tej reakcji
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO
 Metoda enzymatyczna
Metoda z urykazą
- urykaza katalizuje utlenienie kwasu moczowego do alantoiny, czemu
towarzyszy produkcja H2O2 i CO2
- guanina, ksantyna i kilka innych analogów kwasu moczowego może
interferować w tej reakcji (musiałyby występować w stężeniach nie
spotykanych w próbkach biologicznych)
- pomiar:
- w stanie równowagi (po zakończeniu inkubacji)
- pomiar kinetyczny – spadek absorbancji przy 293 nm
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO
Metoda z urykazą sprzężona z układem peroksydazy
z użyciem jednego z wielu akceptorów tlenu i wytworzeniem barwnego
chromogenu:
- 4-aminofenazon z substytutem fenolu = sulfonianem p-hydroksybenzenowym
(reakcja Trindera = peroksydaza/fenol/4-a minoantypiryna) – 546 nm
- hydrazon 3-metylo-1-benzotiazoliny (MBTH)
- 2,2’-azyno-di(3-etylo-benzotiazolino)-6-siarczan (ABTS)
- o-dianizydyna
substancje interferujące:
- kwas askorbinowy (dodaje się oksydazę askorbinianową)
- bilirubina (dodaje się ferrocyjanid)
OZNACZANIE KWASU MOCZOWEGO
Metoda z zastosowaniem HPLC
- metoda referencyjna
- chromatografia jonowymienna lub odwrotnej fazy (RP)
- detektor spektrofotometryczny – 293 nm (detekcja kwasu moczowego w
eluencie)
- czas retencji dla kwasu moczowego: do 6 minut
Proponowana metoda definitywna oznaczania kwasu moczowego to metoda
rozcieńczeń izotopowych sprzężona ze spektrometrią masową (ID-MS).
WARTOŚCI REFERENCYJNE
KWASU MOCZOWEGO
 Dla metod enzymatycznych:
- mężczyźni: 3,5-7,2 mg/dL (0,208-0,428 mmol/L)
- kobiety: 2,6-6,0 mg/dL (0,155-0,357 mmol/L)
stężenie kwasu moczowego:
- zwiększa się wraz z wiekiem – ok. 10% pomiędzy 20 i 60 rokiem życia
- zwiększa się u kobiet po menopauzie (osiągają stężenia takie jak u mężczyzn)
- w ciąży stężenie kwasu moczowego zmniejsza się w ciągu pierwszego
trymestru i utrzymuje się do 24 tygodnia ciąży, kiedy zaczyna się zwiększać
nawet do poziomu wyższego niż przed ciążą
 Współczynnik przeliczeniowy z mg/dL na mmol/L: 0,06
KWAS MOCZOWY
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
 Nieprawidłowe stężenia kwasu moczowego
Hipourykemie (stężenie kwasu moczowego w surowicy < 2 mg/dL)
- leki (allopurinol, salicylany, estrogeny, fenylobutazon)
- radiologiczne środki cieniujące
- niewydolność wątroby
- tubulopatie (zmniejszona resorpcja)
KWAS MOCZOWY
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego >7 mg/dL u mężczyzn i >6
mg/dL u kobiet) - spowodowane zwiększoną syntezą kwasu moczowego
- pierwotne
- idiopatyczne
- dziedziczne choroby metaboliczne
- wtórne
- zbyt duża podaż z dietą
- nasilony obrót metaboliczny puryn np. w białaczkach,
szpiczaku,
- alkohol
KWAS MOCZOWY
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
Hiperurykemie (stężenie kwasu moczowego - spowodowane
zmniejszonym wydalaniem kwasu moczowego
- pierwotne (idiopatyczne)
- wtórne
- ostre i przewlekłe choroby nerek
- zwiększona resorpcja w nerkach
- zmniejszone wydzielanie w nerkach
- zatrucie ołowiem
AMONIAK
 źródła:
- z glutaminy, glutaminianu, alaniny transportowanych do przewodu
pokarmowego, wątroby i nerek
- syntetyzowany w przewodzie pokarmowym przy udziale flory
bakteryjnej jelit
- wbudowywany do mocznika w cyklu mocznikowym
 przy fizjologicznym pH 7,4 amoniak występuje głównie w postaci
zjonizowanej nie przechodzącej przez barierę krew-mózg. W przypadku
zasadowicy wzrasta stężenie postaci niezjonizowanej, przechodzącej do
mózgu i przez zwiększającej ryzyko wystąpienia encefalopatii
 w nerkach amoniak uczestniczy w utrzymaniu równowagi kwasowozasadowej oraz wpływa na zasoby sodu i potasu w organizmie
OZNACZANIE AMONIAKU
 Metoda pośrednia - 2 etapy
Etap 1- przeprowadzenie NH4+ w NH3: techniką dyfuzji izotermalnej lub przy użyciu żywic
kationowymiennych (wymiana a następnie eucja)
Etap 2 - oznaczenie NH4+
- metoda Nesslera
- metoda Berthelota
 Metoda bezpośrednia – enzymatyczna
GLDH
NH4+ + α-ketoglutaran + NADH+H+  glutaminian + NAD+ +H2O
WARTOŚCI REFERENCYJNE AMONIAKU
 Wartości referencyjne stężenia amoniaku wyrażone jako azot (N) w
amoniaku
- noworodki : 64-107 mmol/L (90-150 mg N/dL)
- niemowlęta: 21-50 mmol/L (29-70 mg N/dL)
- dorośli: 15-45 mmol/L (11-32 mg N/dL)
 Stężenie amoniaku w erytrocytach: 100-330 mg N/dL
 Współczynnik przeliczeniowy z mmol/L na mg N/dL: 1,41
z mg N/dL na mmol/L: 0,714
AMONIAK
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
Zwiększone stężenie amoniaku we krwi
Przyczyny wątrobowe:
- marskość wątroby
- ostra niewydolność wątroby
- zapalenie wątroby
- zespół Reye’a
- wrodzone bloki enzymatyczne - zmniejszenie lub brak aktywności enzymów
cyklu mocznikowego
Czynniki pozawątrobowe przy współistniejącym uszkodzeniu wątroby: znaczne
obciążenie białkiem przewodu pokarmowego, zakażenia, alkohol, hipokaliemia,
zasadowica metaboliczna, zaburzone wydalanie nerkowe
DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ