Doskonalenie cech produkcyjnych mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym

Doskonalenie cech produkcyjnych mikroorganizmów

 Procesy biotechnologiczne mikroorganizmów wyizolowanych z zastosowaniem bezpośrednio ze środowiska naturalnego na ogół przebiegają z wydajnością niewystarczającą, aby ich użycie na skalę przemysłową było opłacalne ekonomicznie  Aby wykorzystać potencjał biotechnologiczny tych mikroorganizmów, przeprowadza się modyfikację ich genotypu prowadzącą produkcyjnych do uzyskania szczepów mogących znaleźć zastosowanie w przemyśle

Doskonalenie cech produkcyjnych mikroorganizmów

Modyfikację genotypu szczepu macierzystego, wyizolowanego z próbki środowiskowej scharakteryzowanego taksonomicznie, prowadzi się na i drodze:  mutagenezy indukowanej

in vivo

 fuzji protoplastów komórek szczepów pochodzących od genetycznie różniących się przodków

Mutageneza

  

Mutageneza

- proces prowadzący do powstania mutanta

Mutant

– mikroorganizm różniący się genotypem od komórek szczepu macierzystego zmiany genotypowe w dziedziczone przez komórkach mutanta muszą być trwałe komórki potomne ich obecność musi nadawać szczepowi mutanta właściwości fenotypowe różniące go od szczepu macierzystego

Mutacja

– trwała zmiana w sekwencji DNA, która jest przekazywana komórkom potomnym

Zmiana premutacyjna

– zmiana w sekwencji DNA, która może być usunięta w procesie replikacji

Mutageneza



Mutageneza spontaniczna (samorzutna)

powstawania mutacji zachodzący

–

proces niezależnie od określonych czynników zewnętrznych • błędy popełniane w czasie replikacji DNA • błędy powstające w wyniku samorzutnych modyfikacji chemicznych zasad DNA Częstość mutagenezy spontanicznej  bakteriofag T4 – 10 -7 

Escherichia coli

– 10 -9 

Drosophila melanogaster

– 10 -10

Typy mutacji



Substytucja

– zmiana jednej pary zasad na inną • tranzycja – zmiana jednej puryny na inną purynę lub zmiana jednej pirymidyny na inną pirymidynę • transwersja – zmiana pirymidyny na purynę lub puryny na pirymidynę 5 ’ ACGTAACG 3’ 3 ’ TGCATTGC 5’ 5 ’ ACGTAACG 3’ 3 ’ TGCATTGC 5’ 5 ’ ACGTAACG 3’ 3 ’ TGCA C TGC 5 ’ zmiana premutacyjna 3 ’ TGCA C TGC 5 ’ 5 ’ ACGT G ACG 3 ’ mutacja

Typy mutacji



Delecja

usunięcie jednej lub większej liczby par zasad 5 ’ CCGAAAAACGC 3’ 3 ’ GGCTTTTTGCG 5’ A 5 ’ CCGA AAACGC 3’ 3 ’ GGCT TTTGCG 5’ zmiana premutacyjna 5 ’ CCGAAAAACGC 3’ 3 ’ GGCTTTTTGCG 5’ 3 5 ’ GGCTTTTGCG 5’ ’ CCGAAAACGC 3’ mutacja

Typy mutacji



Insercja

– wstawienie jednej lub większej liczby par zasad 5 ’ CCGAAAAACGC 3’ 3 ’ GGCTTTTTGCG 5’ 5 ’ CCGAAAAACGC 3’ 3 ’ GGCTTTTTGCG 5’ 5 ’ CCGAA AAACGC 3’ 3 ’ GGCTT TTTGCG 5’ T zmiana premutacyjna 3 ’ GGCTTTTTTGCG 5’ 5 ’ CCGAAAAAACGC 3’ mutacja

Mutacje powstające na skutek modyfikacji zasad w DNA



Deaminacja cytozyny

nie

–

powoduje powstanie uracylu, zwiększa poziomu mutacji spontanicznych 

Metylacja cytozyny

metylocytozyny, nie spontanicznych – powoduje zwiększa powstanie poziomu 5 mutacji 

Deaminacja 5-metylocytozyny

tyminy i po replikacji – powoduje powstanie mutację GC → AT

Skutki mutacji

Mutacje punktowe

 zmiana aminokwasu białka pojedynczego w sekwencji  brak zmian aminokwasowej sekwencji białka  przedwczesna translacji terminacja

Delecje lub insercje

  przesunięcie ramki odczytu wstawienie sekwencji lub usunięcie pojedynczego aminokwasu w białka

Mutageneza indukowana



Mutageneza indukowana

mutacji na skutek – proces powstawania działania zewnętrznych czynników fizycznych lub chemicznych 

Typy mutacji indukowanych

• mutacje punktowe (substytucje) • delecje • insercje Powstałe komórki mutantów różnią się genotypowo i fenotypowo od komórek szczepu macierzystego oraz wzajemnie od siebie

Czyniki chemiczne i fizyczne wykorzystywane w doskonaleniu mikroorganizmów na drodze mutagenezy Czynnik mutagenny

Promieniowanie UV Promieniowanie X 5-bromouracyl 2-aminopuryna Hydroksyloamina N-metylo-N’-nitro-N nitrozoguanidyna Metanosulfonian metylowy Metanosulfonian etylowy Oranż akrydyny Kwas azotowy (III)

Sposób działania

powstanie dimerów pirymidynowych pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA analog tyminy, tworzy pary z adeniną i guaniną analog adeniny, tworzy pary z tyminą i cytozyną hydroksylacja cytozyny, pochodna tworzy pary z adeniną synteza metyloguaniny podczas replikacji, powoduje tranzycje i inne typy mutacji alkilacja puryn i pirymidyn interkalacja pomiędzy zasady w DNA, powoduje replikacji i mutacje typu insercja lub delecja deaminacja adeniny, hipoksantyna tworzy pary z cytozyną deaminacja guaniny, ksantyna tworzy pary z cytozyną deaminacja cytozyny, uracyl tworzy pary z adeniną błędy

Mutageneza indukowana

• • • •

Dawka mutagenu

 zbyt do duża dawka czynnika mutagennego prowadzić może śmierci wszystkich komórek szczepu macierzystego poddanych jego działaniu  duże dawki czynnika mutagennego prowadzą do uszkodzenia DNA w wielu miejscach genomu mutacje pożądane mogą być maskowane przez mutacje niekorzystne  

optymalna dawka mutagenu powoduje efekt letalny u max 90% komórek poddawanych mutagenezie

Wielkość dawki czynnika mutagennego zależy od: właściwości szczepu poddawanego mutagenezie warunków hodowli wieku hodowli

Mutageneza indukowana

Promieniowanie UV (254-265 nm) Zalety

  

Wysoka częstotliwość powstawania mutacji w stosunku do efektu letalnego Dostępność i łatwość użycia źródła promieniowania



Łatwość dozowania dawek

• moc lampy • odległość od zawiesiny komórek • czas działania 

Łatwość odtwarzania warunków mutagenezy Możliwość wywołania wegetatywnych i sporach mutacji w rosnących komórkach

Mutageneza indukowana

Promieniowanie UV Sposób postępowania

     przygotować zawiesinę komórek w soli fizjologicznej lub pożywce wzrostowej (10 5 – 10 6 komórek /ml); wysokość warstwy zawiesiny nie powinna przekraczać kilku mm lampę UV umieścić kilkadziesiąt cm nad zawiesiną komórek prowadzić mutagenezę przez kilka minut wysiać zawiesinę w postaci murawy na szalki Petriego z podłożem wzrostowym inkubować w ciemności

Mutageneza indukowana – selekcja mutantów

• •  • •  • 

Mutanty opornościowe

bezpośredni posiew na podłoże zawierające czynnik toksyczny metoda replik

Mutanty kataboliczne

bezpośredni posiew na podłoże z dodatkiem wskaźnika

Mutanty auksotroficzne

bezpośredni posiew na podłoże zawierające śladowe ilości składników, których komórki nie potrafią syntetyzować metoda pośrednia – metoda replik

Selekcja mutantów auksotroficznych - metoda replik

1, 3 – podłoże kompleksowe; 2 – podłoże minimalne

Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej

 

Hybrydyzacja naturalna genetycznej z – przekazanie informacji komórek dawcy do komórek biorcy w wyniku fizycznego kontaktu obu komórek

polega na wymianie homologicznych między chromosomami dawcy i biorcy w wyniku komórkach rozdzielenia potomnych zmienionym genotypie fragmentów DNA materiału genetycznego w otrzymuje się hybrydy o  

Naturalna hybrydyzacja zachodzi bardzo rzadko !!!

Podstawowa przeszkoda:

• ściana komórkowa • ujemny potencjał cytoplazmatycznej po zewnętrznej stronie błony

Ulepszanie szczepów na drodze rekombinacji genetycznej

Hybrydyzacja na drodze fuzji protoplastów (1972 r.)

Protoplasty komórkowej – komórki pozbawione całkowicie ściany Sferoplasty – komórki pozbawione częściowo ściany komórkowej

Zalety hybrydyzacji na drodze fuzji protoplastów



Duża

(10-20%

częstotliwość kariogamii

komórek, które uległy fuzji)

i rekombinacji



Rekombinacja typie płciowym pomiędzy szczepami o tym samym



Rekombinacja międzygatunkowa



Możliwość wymiany dużych fragmentów DNA



Każda z hybrydyzujących komórek może pełnić rolę dawcy i biorcy



Możliwość fuzji protoplastów z zawierającymi obcy materiał genetyczny liposomami

Fuzja protoplastów

Najczęściej stosowana metoda do dalszego ulepszania szczepów pochodzących z różnych linii mutacyjnych  zwiększenie wydajności produkcji  zmiana wymagań pokarmowych  ograniczenie wytwarzania produktów ubocznych  zwiększenie szybkości wzrostu  zmiana przyswajalności różnych substratów  zwiększenie oporności na substancje toksyczne  zwiększenie oporności na bakteriofagi

Fuzja protoplastów

Przygotowanie protoplastów

 Enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej • bakterie G+ i promieniowce - lizozym • grzyby – sok żołądkowy ślimaka

Helix pomatia

 Wymaga środowiska hipertonicznego • siarczan magnezu • sacharoza • sorbitol  pH 5,0 – 7,0 • bufor fosforanowy • bufor fosforanowo-cytrynianowy

Fuzja protoplastów

Czynniki zwiększające efektywność fuzji protoplastów

 30% glikol polietylenowy o MW 1000 – 6000 Da  jony wapnia  odczyn alkaliczny (pH 9,0)  impulsy elektryczne

Fuzja protoplastów

 Plazmogamia – powstanie układu heterokariotycznego  Kariogamia i rekombinacja DNA  Segregacja nowych genotypów na skutek samorzutnej lub indukowanej haploidyzacji  Regeneracja hybrydowych pożywkach ściany komórkowej poprzez inkubację protoplastów w odpowiednio dobranych  Selekcja rekombinantów

Fuzja protoplastów – selekcja rekombinantów

Hodowla na odpowiednio dobranych podłożach selekcyjnych Najczęściej stosowane markery selekcyjne

 markery auksotroficzne  markery morfologiczne  markery oporności na antybiotyki