Transcript KERAGAMAN GENETIK RUMPUT LAUT (Eucheuma spp.) DARI
Slide 1
KOLOKIUM
KERAGAMAN GENETIK RUMPUT LAUT (Eucheuma spp.)
DARI SUKABUMI, JAWA BARAT
DENGAN MENGGUNAKAN METODE RAPD PCR
Oleh :
PUTRI INDAH AYUNINGRUM
230210080024
Dosen Pembimbing :
Dr. Ir. Eddy Afrianto, M.Si. & Yuniar Mulyani, SP., Msi
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN
2012
Slide 2
CONTENT :
LATAR BELAKANG
IDENTIFIKASI MASALAH
TUJUAN PENELITIAN
KEGUNAAN PENELITIAN
PENDEKATAN MASALAH
METODE PENELITIAN
KESIMPULAN & SARAN
Slide 3
LATAR BELAKANG
Pemanfaatan
Rumput Laut
Berbagai jenis rumput laut ekonomis tinggi, telah
berhasil dibudidayakan di perairan Indonesia
Sejak tahun 2010
Indonesia menjadi no 1
Slide 4
Sukabumi merupakan salah satu tempat usaha budidaya
rumput laut yang cukup berhasil di Indonesia
Evaluasi hubungan
genetik dari koleksi
plasma nutfah jenis
Eucheuma spp.
Belum banyak
dilakukan
Eucheuma spp.
salah satu cara dari managemen populasi
menunjang aspek eksplorasi
melalui program pemuliaan dan
pelestarian plasma nutfah Hasil
Kekayaan Laut Indonesia
langkah konservasinya
akan lebih terarah
Slide 5
Identifikasi masalah
sejauhmana
keragaman genetik
Eucheuma spp dapat
terdeteksi dengan
teknik RAPD PCR
Tujuan Penelitian
mendapatkan
keragaman genetik dan
kekerabatan individu
antar spesies melalui
peta sidik jari (fingerprint)
dari Eucheuma spp yang
berasal dari kawasan
budidaya dan liar
Slide 6
diperoleh informasi mengenai
keragaman genetik rumput laut jenis
Eucheuma yang terdapat di budidaya
dan rumput laut Eucheuma endemis di
perairan Sukabumi, Jawa Barat
Kegunaan
Penelitian
diperoleh data molekuler dalam
rangka menambah informasi
database keragaman genetik rumput
laut endemik perairan Sukabumi,
Jawa Barat
koleksi backup data varietas rumput
laut unggul guna perbaikan mutu
genetik rumput laut pada masa yang
akan datang
Slide 7
PENDEKATAN MASALAH
Polimorfisme tingkat DNA
RFLP, RAPD, Mikrosatelit
Isolasi DNA
Pelestarian Plasma Nutfah
RAPD-PCR
Slide 8
RAPD-PCR
PCR-RAPD merupakan salah satu teknik molekuler berupa
penggunaan penanda tertentu untuk mempelajari
keanekaragaman genetika
Slide 9
METODE PENELITIAN
Waktu & Tempat Penelitian
Metode Penelitian
Alat & Bahan
Prosedur Penelitian
Slide 10
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian
dilakukan
selama 3 bulan,
mulai dari bulan
April sampai
dengan Juni
2012.
Sampel Rumput
Laut diambil di
daerah
Sukabumi, Jawa
Barat
Analisis data
dilakukan di
Laboratorium
Bioteknologi
Fakultas
Perikanan dan
Ilmu Kelautan
Universitas
Padjadjaran
Slide 11
Bahan – Bahan Penelitian
No
Nama Bahan
1
(4:1) Ethanol : gliserol
2
Sampel Rumput Laut
3
Aquadest
4
Es curai
5
2-Merkaptoetanol
6
Polyvinylpyrolidone (PVP)
7
Kloroform ; Isoamilalkohol (24:1)
8
Isopropanol
9
Etanol 80%
10
TE 10/1 (1mM Tris HC, 0 ,1mM EDTA, pH 8)
11
Buffer CTAB
12
Agarose
13
Larutan Tris Borat EDTA (TBE)
14
Marker λ cut EcoR I/ Hind III
15
Larutan EtBr
16
Primer RAPD
17
GoTaq green Master Mix (PROMEGA)
18
NFW
Slide 12
Alat – Alat Penelitian
No
Peralatan
Kegunaan
A.
Proses Pengambilan sampel
1
Botol Film
Menyimpan potongan jaringan sampel
2
Gunting
Memotong sampel
3
Pinset
Mengambil sampel
4
Timbangan
Untuk menimbang sampel
B.
Proses Isolasi DNA
1
autoclave
Mensterilkan alat dan bahan
2
Micro tube
Wadah sampel
3
Rak micro tube
Tempat dudukan micro tube
4
Penggerus
Penghancuran jaringan target sampel
5
sentrifugasi
Pemisahan larutan dengan supernatan
6
Water bath
Inkubasi saat ekstraksi DNA
7
Mikropipet dan Micro Tips
Meneteskan pelarut
8
vortex-mixer
Menghomogenkan Larutan
9
Kulkas
Menyimpan Larutan Kit untuk Ekstraksi
10
timer
Untuk mengingatkan lamanya tahap pengerjaan
Slide 13
Alat – Alat Penelitian
No
C.
1
2
3
Peralatan
4
5
Elektroforesis
Timbangan Analitik
Gelas Ukur
Cetakan Agar Elektroforesis
(agarose)
Hot Plate Magnetic Stirrer
Alat Elekroforesis
D.
1
2
3
4
5
Proses Analisis Hasil Elektroforesis
Ultraviolet Illuminator
wadah gelap dan tertutup
Sendok pipih
Kamera Digital
Komputer
E.
1.
Penyimpanan Isolat DNA
Freezer (<-200 C)
Kegunaan
Menimbang takaran Agarose
Menakar larutan TBE
Mencetak agar agarose dan membuat sumursumur untuk penempatan hasil ekstraksi
Memasak larutan Agarose dengan pelarut TBE
Memisahkan strand dengan dengan bantuan arus
listrik
Memendarkan cahaya
Tempat staining agar dengan larutan EtBr
Untuk memindahkan agar agarose
Untuk memotret hasil elektroforesis
Untuk proses editing dan interpretasi hasil
pemotretan dengan software Adobe Photoshop
Tempat menyimpan hasil isolasi DNA dalam waktu
yang lama
Slide 14
MetodePenelitian
metode survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitian
dilakukan dalam beberapa tahap yakni pengambilan sampel,
penelitian di laboratorium dan selanjutnya analisis data.
Sebelum pelaksanaan penelitian ini dilakukan uji pendahuluan
guna menentukan primer yang akan digunakan untuk siklus PCR
dengan jenis sampel rumput laut Eucheuma spp.
Slide 15
Prosedur Penelitian
Sampling
Isolasi DNA
Amplifikasi DNA
Analisis data
Slide 16
Sampling
•
•
•
•
•
A, B, C
D
Lokasi (A) : Rumput Laut
Budidaya 1 (Kp Pamipiran) S :
07°04’55,6’’ & E : 106°30’59,9’’
Lokasi (B) : Rumput Laut
Budidaya 2 (Kp Sagorayang) S :
07°05’17,8’’ & E : 106°30’33,2’’
Lokasi (C) : Rumput Laut
Budidaya 3 (Kp Cipeundeuy) S :
07°05’40,2’’ & E : 106°30’20,1’’
Lokasi (D) : Rumput Laut Liar 4
(Kp Pamipiran) S : 07°04’59,2’’ &
E : 106°31’64,9’’
Lokasi (E) : Rumput Laut Liar 5
(Ujung Genteng) S : 07°22’40,6’’
& E : 106°24’04,9’’
E
Slide 17
Isolasi DNA
Sterilisasi
Pemecahan Sel
Ekstraksi DNA
Presipitasi DNA
DNA
Sampel rumput laut +/- 0,3 gr, ditambah buffer CTAB 500ml
sbnyk 10 ul + PVP, digerus dengan mortar
Masukkan kdlm tube 0,5, ditambah CTAB (Preheated 65oC) 140
ul + 10 ul 2-Merkaptoetanol, lalu di vortex
Inkubasi suhu 65oC 60 menit, stp 15 menit dibolak-balik
Tambahkan 500ul C:I (24:1), lalu di Vortex
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Supernatan diambil, pindahkan ke tabung baru
Tambahkan P:C:I (25:24:1) 100ul
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Supernatan diambil, pindahkan ke tabung baru
Tambahkan Isopropanol 2xvol
Tubes dibolak-balik
Simpan pada suhu -20oC, 60 menit
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Buang Supernatan (sisa pellet DNA)
Tambahkan etanol 80% dingin sebanyak 600ul
Tubes dibolak-balik
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Buang Supernatan (sisa pellet DNA)
Dikering-anginkan selama 15 menit
Tambahkan TE (10:1) sebanyak 100ul
Flick sampai pellet larut
Simpan pada suhu -20oC
Slide 18
Elektoforesis DNA Genom
Kedalam Erlenmeyer, masukkan 0,56gr Agarose
Tambahkan 40mL TBE 0,5x
Homogenkan dan didihkan dengan Hotplate
Kemudian dicetak dengan alat cetakan elektroforesis
Setelah agar beku, dan cetakan sisirnya (sumur) sudah dilepas,
pindahkan kedalam alat elektroforesis
Pencetakan agar
Elektroforesis
ditempat lain, lakukan mix terhadap 3ul Sampel DNA dan 2ul
Load dye dengan Mikropipet
Masukkan kedalam masing-masing sumur
masukkan jg working solution 5 ul ke sumur lainnya
Running elektroforesis pada 75v, selama 60 menit
Elektroforesis
Setelah running elektro selesai, agar tadi direndam (diwarnai) pada
larutan EtBr kons 2*g/m slm 15 menit
Pengamatan pada UV
kemudian gel dibilas dengan aquades selama 15 menit
Pengamatan Hasil Elektro, dilakukan pada lampu UV
kemudian dilakukan proses dokumentasi
Slide 19
Elektrofenogram DNA sampel Eucheuma spp
Ukuran DNA sangat
beragam
Pengukuran Kemurnian
dan Konsentrasi DNA
Slide 20
Hasil Spektrofotometri DNA Eucheuma spp.
Nilai R:
<1,8 =
masih
dikotori o/
Protein
>2 = masih
belum
murni dari
pengotor
RNA
(sambrook
et al 1989)
Slide 21
Amplifikasi DNA
Primer OPA-2, OPA-3
Kedalam setiap Tube dimasukkan Reaksi : 12,5 ul Master
Mix, Primer 1ul, DNA 2ul, dan NFW 9,5 ul
Sentrifugasi (short spin) 10 detik, 3000rpm
PCR
Setelah selesai, diamkan 5 menit, lalu tempatkan pada suhu
-20oC
Proses
Waktu
Suhu
Siklus
Pra PCR
-
Denaturasi
5 menit
940C
1
-
Annealing
60 detik
370C
1
Extension
120 detik
720C
1
-
Denaturasi
60 detik
920C
44
-
Annealing
60 detik
370C
44
120 detik
720C
44
8 menit
720C
1
PCR
-
Extension
Post Extension
Slide 22
Elektoforesis Hasil PCR
Kedalam Erlenmeyer, masukkan 0,56gr Agarose
Tambahkan 40mL TBE 0,5x
Homogenkan dan didihkan dengan Hotplate
Kemudian dicetak dengan alat cetakan elektroforesis
Pencetakan agar
Elektroforesis
Setelah agar beku, dan cetakan sisirnya (sumur) sudah dilepas,
pindahkan kedalam alat elektroforesis
Masukkan kedalam masing-masing sumur 6ul hasil PCR
masukkan jg working solution 5 ul ke sumur lainnya
Running elektroforesis pada 75v, selama 60 menit
Elektroforesis
Setelah running elektro selesai, agar tadi direndam (diwarnai) pada
larutan EtBr kons 2*g/m slm 15 menit
kemudian gel dibilas dengan aquades selama 15 menit
Pengamatan pada UV
Pengamatan Hasil Elektro, dilakukan pada lampu UV
kemudian dilakukan proses dokumentasi
Slide 23
HASIL AMPLIFIKASI DNA
E.Cottonii
lokasi A
E.Cottonii
lokasi B
Setiap primer mampu
menghasilkan pola pita di
setiap sampel
E.Cottonii
lokasi C
Menghasilkan produk
amplifikasi yang berbedabeda
E.Serra
lokasi D
E.Denticulatum
lokasi E
Polimorfisme
Slide 24
Jumlah pola larik DNA dari setiap primer yang
digunakan untuk sampel
Eucheuma spp di Sukabumi, Jawa Barat
Primer
Urutan
5l
Jumlah Pola Larik
3l
Polimorfik
Monomorfik
OPA-2
TGCGGAGCTG
5
10 %
42
90 %
OPA-3
AGTCAGCCAC
10
14%
62
86 %
Polimorfisme ditandai dengan ada
dan tidak adanya pola larik DNA
OPA-03 lebih sensitif dalam
mengkopi pasangan basa
Larik ini tidak dapat dijadikan dasar
perbandingan karakter fenotipe
secara langsung
Slide 25
Analisis Data
Pita yg tervisualisasi melalui
elektroforesis merupakan
representasi dri fragmen DNA yg
teramplifikasi.
Hubungan setiap sampel DNA
ditentukan dgn menhitung indeks
kesamaannya berdasarkan data
numerik larik yg teramplifikasi.
Indeks kesamaan ini dihitung
dengan menggunakan program
NTSys pc.
Dendogram Eucheuma spp.
Dengan Primer OPA-2 & OPA-3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.24
0.39
0.54
Kesamaan Genetik
0.69
0.83
Slide 26
Pohon Filogenik kesamaan genetik hasil analisis UPGMA
menggunakan primer OPA-02
Slide 27
Pohon Filogenik kesamaan genetik hasil analisis UPGMA
menggunakan primer OPA-03
Slide 28
Pohon Filogenik kesamaan genetik hasil analisis UPGMA
menggunakan primer OPA-02 & OPA-03
Lokasi A
Lokasi B
Lokasi C
Lokasi D
Lokasi E
Tidak memperlihatkan hubungan dengan kondisi geografi
Populasi yang berdekatan cenderung membentuk satu kolompok
Karena Pola perkembangbiakan yang berupa vegetatif
Keragaman genetik yang rendah pada sampel rumput laut di lokasi A-D
Salah satu tujuan dari konservasi adalah mempertahankan keragaman genetik
Slide 29
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini maka dapat disimpulkan sebagai berikut:
1. Metode “Random Amplified Polymorphic DNA” dapat digunakan untuk
melihat keragaman genetik rumput laut jenis Eucheuma spp yang didapatkan
dari lokasi budidaya dan perairan Sukabumi, Jawa Barat.
2. Jumlah larik polimorfik yang dihasilkan primer OPA-03 lebih banyak
dibanding primer OPA-2, sehingga lebih sensitif.
3. Rumput laut dari lokasi budidaya yakni Eucheuma cottonii memiliki
kesamaan genetik yang cukup dekat dengan rumput laut yang tumbuh liar di
perairan Sukabumi yakni dengan jenis Eucheuma serra, keduanya memiliki
indeks kesamaan genetik sebesar 0,57 dan memiliki indeks kesamaan yang
cukup jauh dengan Eucheuma denticulatum yakni sebesar 0,18.
Slide 30
SARAN
Perlunya dilakukan pengujian terhadap lebih banyak sampel rumput laut jenis
Eucheuma spp lagi agar dapat lebih menerangkan keragaman genetik rumput laut
ini dan perlunya dilakukan pengujian terhadap primer-primer lain selain OPA-02
dan OPA-03.
Slide 31
TERIMA KASIH..
Slide 32
KOLOKIUM
KERAGAMAN GENETIK RUMPUT LAUT (Eucheuma spp.)
DARI SUKABUMI, JAWA BARAT
DENGAN MENGGUNAKAN METODE RAPD PCR
Oleh :
PUTRI INDAH AYUNINGRUM
230210080024
Dosen Pembimbing :
Dr. Ir. Eddy Afrianto, M.Si. & Yuniar Mulyani, SP., Msi
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN
2012
KOLOKIUM
KERAGAMAN GENETIK RUMPUT LAUT (Eucheuma spp.)
DARI SUKABUMI, JAWA BARAT
DENGAN MENGGUNAKAN METODE RAPD PCR
Oleh :
PUTRI INDAH AYUNINGRUM
230210080024
Dosen Pembimbing :
Dr. Ir. Eddy Afrianto, M.Si. & Yuniar Mulyani, SP., Msi
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN
2012
Slide 2
CONTENT :
LATAR BELAKANG
IDENTIFIKASI MASALAH
TUJUAN PENELITIAN
KEGUNAAN PENELITIAN
PENDEKATAN MASALAH
METODE PENELITIAN
KESIMPULAN & SARAN
Slide 3
LATAR BELAKANG
Pemanfaatan
Rumput Laut
Berbagai jenis rumput laut ekonomis tinggi, telah
berhasil dibudidayakan di perairan Indonesia
Sejak tahun 2010
Indonesia menjadi no 1
Slide 4
Sukabumi merupakan salah satu tempat usaha budidaya
rumput laut yang cukup berhasil di Indonesia
Evaluasi hubungan
genetik dari koleksi
plasma nutfah jenis
Eucheuma spp.
Belum banyak
dilakukan
Eucheuma spp.
salah satu cara dari managemen populasi
menunjang aspek eksplorasi
melalui program pemuliaan dan
pelestarian plasma nutfah Hasil
Kekayaan Laut Indonesia
langkah konservasinya
akan lebih terarah
Slide 5
Identifikasi masalah
sejauhmana
keragaman genetik
Eucheuma spp dapat
terdeteksi dengan
teknik RAPD PCR
Tujuan Penelitian
mendapatkan
keragaman genetik dan
kekerabatan individu
antar spesies melalui
peta sidik jari (fingerprint)
dari Eucheuma spp yang
berasal dari kawasan
budidaya dan liar
Slide 6
diperoleh informasi mengenai
keragaman genetik rumput laut jenis
Eucheuma yang terdapat di budidaya
dan rumput laut Eucheuma endemis di
perairan Sukabumi, Jawa Barat
Kegunaan
Penelitian
diperoleh data molekuler dalam
rangka menambah informasi
database keragaman genetik rumput
laut endemik perairan Sukabumi,
Jawa Barat
koleksi backup data varietas rumput
laut unggul guna perbaikan mutu
genetik rumput laut pada masa yang
akan datang
Slide 7
PENDEKATAN MASALAH
Polimorfisme tingkat DNA
RFLP, RAPD, Mikrosatelit
Isolasi DNA
Pelestarian Plasma Nutfah
RAPD-PCR
Slide 8
RAPD-PCR
PCR-RAPD merupakan salah satu teknik molekuler berupa
penggunaan penanda tertentu untuk mempelajari
keanekaragaman genetika
Slide 9
METODE PENELITIAN
Waktu & Tempat Penelitian
Metode Penelitian
Alat & Bahan
Prosedur Penelitian
Slide 10
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian
dilakukan
selama 3 bulan,
mulai dari bulan
April sampai
dengan Juni
2012.
Sampel Rumput
Laut diambil di
daerah
Sukabumi, Jawa
Barat
Analisis data
dilakukan di
Laboratorium
Bioteknologi
Fakultas
Perikanan dan
Ilmu Kelautan
Universitas
Padjadjaran
Slide 11
Bahan – Bahan Penelitian
No
Nama Bahan
1
(4:1) Ethanol : gliserol
2
Sampel Rumput Laut
3
Aquadest
4
Es curai
5
2-Merkaptoetanol
6
Polyvinylpyrolidone (PVP)
7
Kloroform ; Isoamilalkohol (24:1)
8
Isopropanol
9
Etanol 80%
10
TE 10/1 (1mM Tris HC, 0 ,1mM EDTA, pH 8)
11
Buffer CTAB
12
Agarose
13
Larutan Tris Borat EDTA (TBE)
14
Marker λ cut EcoR I/ Hind III
15
Larutan EtBr
16
Primer RAPD
17
GoTaq green Master Mix (PROMEGA)
18
NFW
Slide 12
Alat – Alat Penelitian
No
Peralatan
Kegunaan
A.
Proses Pengambilan sampel
1
Botol Film
Menyimpan potongan jaringan sampel
2
Gunting
Memotong sampel
3
Pinset
Mengambil sampel
4
Timbangan
Untuk menimbang sampel
B.
Proses Isolasi DNA
1
autoclave
Mensterilkan alat dan bahan
2
Micro tube
Wadah sampel
3
Rak micro tube
Tempat dudukan micro tube
4
Penggerus
Penghancuran jaringan target sampel
5
sentrifugasi
Pemisahan larutan dengan supernatan
6
Water bath
Inkubasi saat ekstraksi DNA
7
Mikropipet dan Micro Tips
Meneteskan pelarut
8
vortex-mixer
Menghomogenkan Larutan
9
Kulkas
Menyimpan Larutan Kit untuk Ekstraksi
10
timer
Untuk mengingatkan lamanya tahap pengerjaan
Slide 13
Alat – Alat Penelitian
No
C.
1
2
3
Peralatan
4
5
Elektroforesis
Timbangan Analitik
Gelas Ukur
Cetakan Agar Elektroforesis
(agarose)
Hot Plate Magnetic Stirrer
Alat Elekroforesis
D.
1
2
3
4
5
Proses Analisis Hasil Elektroforesis
Ultraviolet Illuminator
wadah gelap dan tertutup
Sendok pipih
Kamera Digital
Komputer
E.
1.
Penyimpanan Isolat DNA
Freezer (<-200 C)
Kegunaan
Menimbang takaran Agarose
Menakar larutan TBE
Mencetak agar agarose dan membuat sumursumur untuk penempatan hasil ekstraksi
Memasak larutan Agarose dengan pelarut TBE
Memisahkan strand dengan dengan bantuan arus
listrik
Memendarkan cahaya
Tempat staining agar dengan larutan EtBr
Untuk memindahkan agar agarose
Untuk memotret hasil elektroforesis
Untuk proses editing dan interpretasi hasil
pemotretan dengan software Adobe Photoshop
Tempat menyimpan hasil isolasi DNA dalam waktu
yang lama
Slide 14
MetodePenelitian
metode survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitian
dilakukan dalam beberapa tahap yakni pengambilan sampel,
penelitian di laboratorium dan selanjutnya analisis data.
Sebelum pelaksanaan penelitian ini dilakukan uji pendahuluan
guna menentukan primer yang akan digunakan untuk siklus PCR
dengan jenis sampel rumput laut Eucheuma spp.
Slide 15
Prosedur Penelitian
Sampling
Isolasi DNA
Amplifikasi DNA
Analisis data
Slide 16
Sampling
•
•
•
•
•
A, B, C
D
Lokasi (A) : Rumput Laut
Budidaya 1 (Kp Pamipiran) S :
07°04’55,6’’ & E : 106°30’59,9’’
Lokasi (B) : Rumput Laut
Budidaya 2 (Kp Sagorayang) S :
07°05’17,8’’ & E : 106°30’33,2’’
Lokasi (C) : Rumput Laut
Budidaya 3 (Kp Cipeundeuy) S :
07°05’40,2’’ & E : 106°30’20,1’’
Lokasi (D) : Rumput Laut Liar 4
(Kp Pamipiran) S : 07°04’59,2’’ &
E : 106°31’64,9’’
Lokasi (E) : Rumput Laut Liar 5
(Ujung Genteng) S : 07°22’40,6’’
& E : 106°24’04,9’’
E
Slide 17
Isolasi DNA
Sterilisasi
Pemecahan Sel
Ekstraksi DNA
Presipitasi DNA
DNA
Sampel rumput laut +/- 0,3 gr, ditambah buffer CTAB 500ml
sbnyk 10 ul + PVP, digerus dengan mortar
Masukkan kdlm tube 0,5, ditambah CTAB (Preheated 65oC) 140
ul + 10 ul 2-Merkaptoetanol, lalu di vortex
Inkubasi suhu 65oC 60 menit, stp 15 menit dibolak-balik
Tambahkan 500ul C:I (24:1), lalu di Vortex
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Supernatan diambil, pindahkan ke tabung baru
Tambahkan P:C:I (25:24:1) 100ul
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Supernatan diambil, pindahkan ke tabung baru
Tambahkan Isopropanol 2xvol
Tubes dibolak-balik
Simpan pada suhu -20oC, 60 menit
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Buang Supernatan (sisa pellet DNA)
Tambahkan etanol 80% dingin sebanyak 600ul
Tubes dibolak-balik
Sentrifugasi 13000rpm, 15 menit
Buang Supernatan (sisa pellet DNA)
Dikering-anginkan selama 15 menit
Tambahkan TE (10:1) sebanyak 100ul
Flick sampai pellet larut
Simpan pada suhu -20oC
Slide 18
Elektoforesis DNA Genom
Kedalam Erlenmeyer, masukkan 0,56gr Agarose
Tambahkan 40mL TBE 0,5x
Homogenkan dan didihkan dengan Hotplate
Kemudian dicetak dengan alat cetakan elektroforesis
Setelah agar beku, dan cetakan sisirnya (sumur) sudah dilepas,
pindahkan kedalam alat elektroforesis
Pencetakan agar
Elektroforesis
ditempat lain, lakukan mix terhadap 3ul Sampel DNA dan 2ul
Load dye dengan Mikropipet
Masukkan kedalam masing-masing sumur
masukkan jg working solution 5 ul ke sumur lainnya
Running elektroforesis pada 75v, selama 60 menit
Elektroforesis
Setelah running elektro selesai, agar tadi direndam (diwarnai) pada
larutan EtBr kons 2*g/m slm 15 menit
Pengamatan pada UV
kemudian gel dibilas dengan aquades selama 15 menit
Pengamatan Hasil Elektro, dilakukan pada lampu UV
kemudian dilakukan proses dokumentasi
Slide 19
Elektrofenogram DNA sampel Eucheuma spp
Ukuran DNA sangat
beragam
Pengukuran Kemurnian
dan Konsentrasi DNA
Slide 20
Hasil Spektrofotometri DNA Eucheuma spp.
Nilai R:
<1,8 =
masih
dikotori o/
Protein
>2 = masih
belum
murni dari
pengotor
RNA
(sambrook
et al 1989)
Slide 21
Amplifikasi DNA
Primer OPA-2, OPA-3
Kedalam setiap Tube dimasukkan Reaksi : 12,5 ul Master
Mix, Primer 1ul, DNA 2ul, dan NFW 9,5 ul
Sentrifugasi (short spin) 10 detik, 3000rpm
PCR
Setelah selesai, diamkan 5 menit, lalu tempatkan pada suhu
-20oC
Proses
Waktu
Suhu
Siklus
Pra PCR
-
Denaturasi
5 menit
940C
1
-
Annealing
60 detik
370C
1
Extension
120 detik
720C
1
-
Denaturasi
60 detik
920C
44
-
Annealing
60 detik
370C
44
120 detik
720C
44
8 menit
720C
1
PCR
-
Extension
Post Extension
Slide 22
Elektoforesis Hasil PCR
Kedalam Erlenmeyer, masukkan 0,56gr Agarose
Tambahkan 40mL TBE 0,5x
Homogenkan dan didihkan dengan Hotplate
Kemudian dicetak dengan alat cetakan elektroforesis
Pencetakan agar
Elektroforesis
Setelah agar beku, dan cetakan sisirnya (sumur) sudah dilepas,
pindahkan kedalam alat elektroforesis
Masukkan kedalam masing-masing sumur 6ul hasil PCR
masukkan jg working solution 5 ul ke sumur lainnya
Running elektroforesis pada 75v, selama 60 menit
Elektroforesis
Setelah running elektro selesai, agar tadi direndam (diwarnai) pada
larutan EtBr kons 2*g/m slm 15 menit
kemudian gel dibilas dengan aquades selama 15 menit
Pengamatan pada UV
Pengamatan Hasil Elektro, dilakukan pada lampu UV
kemudian dilakukan proses dokumentasi
Slide 23
HASIL AMPLIFIKASI DNA
E.Cottonii
lokasi A
E.Cottonii
lokasi B
Setiap primer mampu
menghasilkan pola pita di
setiap sampel
E.Cottonii
lokasi C
Menghasilkan produk
amplifikasi yang berbedabeda
E.Serra
lokasi D
E.Denticulatum
lokasi E
Polimorfisme
Slide 24
Jumlah pola larik DNA dari setiap primer yang
digunakan untuk sampel
Eucheuma spp di Sukabumi, Jawa Barat
Primer
Urutan
5l
Jumlah Pola Larik
3l
Polimorfik
Monomorfik
OPA-2
TGCGGAGCTG
5
10 %
42
90 %
OPA-3
AGTCAGCCAC
10
14%
62
86 %
Polimorfisme ditandai dengan ada
dan tidak adanya pola larik DNA
OPA-03 lebih sensitif dalam
mengkopi pasangan basa
Larik ini tidak dapat dijadikan dasar
perbandingan karakter fenotipe
secara langsung
Slide 25
Analisis Data
Pita yg tervisualisasi melalui
elektroforesis merupakan
representasi dri fragmen DNA yg
teramplifikasi.
Hubungan setiap sampel DNA
ditentukan dgn menhitung indeks
kesamaannya berdasarkan data
numerik larik yg teramplifikasi.
Indeks kesamaan ini dihitung
dengan menggunakan program
NTSys pc.
Dendogram Eucheuma spp.
Dengan Primer OPA-2 & OPA-3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.24
0.39
0.54
Kesamaan Genetik
0.69
0.83
Slide 26
Pohon Filogenik kesamaan genetik hasil analisis UPGMA
menggunakan primer OPA-02
Slide 27
Pohon Filogenik kesamaan genetik hasil analisis UPGMA
menggunakan primer OPA-03
Slide 28
Pohon Filogenik kesamaan genetik hasil analisis UPGMA
menggunakan primer OPA-02 & OPA-03
Lokasi A
Lokasi B
Lokasi C
Lokasi D
Lokasi E
Tidak memperlihatkan hubungan dengan kondisi geografi
Populasi yang berdekatan cenderung membentuk satu kolompok
Karena Pola perkembangbiakan yang berupa vegetatif
Keragaman genetik yang rendah pada sampel rumput laut di lokasi A-D
Salah satu tujuan dari konservasi adalah mempertahankan keragaman genetik
Slide 29
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini maka dapat disimpulkan sebagai berikut:
1. Metode “Random Amplified Polymorphic DNA” dapat digunakan untuk
melihat keragaman genetik rumput laut jenis Eucheuma spp yang didapatkan
dari lokasi budidaya dan perairan Sukabumi, Jawa Barat.
2. Jumlah larik polimorfik yang dihasilkan primer OPA-03 lebih banyak
dibanding primer OPA-2, sehingga lebih sensitif.
3. Rumput laut dari lokasi budidaya yakni Eucheuma cottonii memiliki
kesamaan genetik yang cukup dekat dengan rumput laut yang tumbuh liar di
perairan Sukabumi yakni dengan jenis Eucheuma serra, keduanya memiliki
indeks kesamaan genetik sebesar 0,57 dan memiliki indeks kesamaan yang
cukup jauh dengan Eucheuma denticulatum yakni sebesar 0,18.
Slide 30
SARAN
Perlunya dilakukan pengujian terhadap lebih banyak sampel rumput laut jenis
Eucheuma spp lagi agar dapat lebih menerangkan keragaman genetik rumput laut
ini dan perlunya dilakukan pengujian terhadap primer-primer lain selain OPA-02
dan OPA-03.
Slide 31
TERIMA KASIH..
Slide 32
KOLOKIUM
KERAGAMAN GENETIK RUMPUT LAUT (Eucheuma spp.)
DARI SUKABUMI, JAWA BARAT
DENGAN MENGGUNAKAN METODE RAPD PCR
Oleh :
PUTRI INDAH AYUNINGRUM
230210080024
Dosen Pembimbing :
Dr. Ir. Eddy Afrianto, M.Si. & Yuniar Mulyani, SP., Msi
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN
2012