Transcript Sequenziamento

Sequenziamento: metodo di Sanger con ddNTP
Sequenziamento con
dideossonucleotidi
Sequenziamento automatizzato del DNA
Clonaggio:
Inserto
Vettore
+
Ligazione
Trattamento del vettore con fosfatasi
AATTC
G
G
CTTAA
pAATTC
G
G
CTTAAp
fosfatasi
DNA ligasi
pAATTC
G
G
CTTAAp
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Vettori plasmidici (pBR322)
Vettori plasmidici (pUC18)
•Ceppo di E.coli Lac Z mutante
•Vettore pUC LacZ parziale
•Ceppo di E.coli Lac Z mutante
•Vettore LacZ interrotto dal
clonaggio
Complementano
Non c’è
complementazione
β-galattosidasi
ATTIVA
Metabolizzato
Terreno + X-Gal
β-galattosidasi
Non metabolizzato
INATTIVA
X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore)
β-galattosidasi
ATTIVA
β-galattosidasi
INATTIVA
Colonie
Blu
Colonie
bianche
1° ciclo di PCR
DNA genomico
5’
3’
3’
Primer reverse
5’
3’
Primer forward
DNA genomico
5’
3’
5’
ETEROGENEITA’ DEL TEMPLATO : ETEROZIGOSI PER UNA DELEZIONE
C A G C A G C A G C A G C A C C T C A G
C A G C A G C A G C A C C T C A G G G G
F
P
M
C/C
G/-
C/-
LOSS OF HETEROZYGOSITY
RNA sequencing
Dopo
trascrizione
inversa
6
8
6
7
7/-
8
CTT
7/-
-/-
Figure 1: Illumina Flow
Cell
Figure 2: Prepare Genomic
DNA Sample
DNA
Figure 3: Attach DNA to
Adapters
Surface
DNA
Dense lawn
of primers
Figure 4: Bridge
Amplification
Adapters
Figure 5: Fragments Become
Double Stranded
Attached
terminus
Figure 6: Denature the
Double-Standed Molecules
Attached
terminus
Free
terminus
Attached
Attached
Figure 7: Complete
Amplification
Figure 8: Determine First
Base
Clusters
Laser
Figure 9: Image First
Base
Figure 10: Determine
Second Base
Figure 11: Image
Second Chemistry
Cycle
Figure 12: Sequencing Over
Multiple Chemistry Cycles
Figure 13: Align Data
Laser
GCTGA...