Transcript Определение LOD для ГМО - Baltic Bio Trade
Slide 1
Определение чужеродного
генетического материала в
продуктах питания
Рекомендации
2007
Slide 2
Правильно ли вы определяете ГМО?
Slide 3
Topics of Talk
• Введение
• Основы определения ГМО
• Критические замечания по
определению ГМО
Slide 4
Темы
• Процедура анализа ГМО
– Размер образца и аналитический образец
– Экстракция и очистка ДНК
– ПЦР: Специфичность, LOD и определение
количества
• Контроль качества
– Контроли ПЦР
– Внутренние контрольные образцы
Slide 5
Контроль ГМО и правила
маркировки
Европейская маркировка ГМО и
пороговая толерантность
Маркировка ГМО
0.9%
0.5%
Ноль
Толерантность к контаминация
неизбежными/случайными разрешенными ГМО
Толерантность к не авторизованным безопасным ГМО
контаминациям
Нулевая толерантность к запрещенным ГМО
Slide 6
Кабинет Министров Украины постановлением от 13 мая
2009 г. N 468 « Про утверждение Порядка маркировки
пищевых продуктов, которые содержат генетически
модифицированные организмы или сделанные с их
использованием и вводятся в оборот» установил:
«Етикетування харчових продуктів, які містять генетично
модифіковані організми обсягом понад 0,9 відсотка або
вироблені із сільськогосподарської продукції, вміст генетично
модифікованих організмів у якій становить понад 0,9
відсотка, повинне проводитися їх виробником
(постачальником) із зазначенням відповідної інформації.»
Файл:
Slide 7
Два подхода к
анализу ГМО
Трансген
Нормальная
клетка
Определение
новых генов ПЦР
Определение
новых белков
иммуноанализом
Трансгенная
клетка
Slide 8
Основные принципы ПЦР
• ГМО содержат уникальные
последовательности ДНК
• Ключ к процедуре поиска: “праймера”
• Высокая чувствительность поиска
связанна с процессом умножения в
ПЦР
Slide 9
Распознавание Праймеров
(Реакция гибридизации)
Slide 10
Количество
циклов ПЦР
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
20
30
40
Количество
молекул ДНК
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
1,000,000
1,000,000,000
1,000,000,000,000
Slide 11
Специфичность ПЦР
Подтверждение специфичности праймеров
Образцы 1-10:
Walnut, Hazelnut, Peanut, Pecan, Prune, Apricot,
Nectarine, Pear, Strawberry, Pistachio
Slide 12
Анализ ПЦР
• Высокая чувствительность
• Высокая специфичность
• Работает со всеми ГМО (все ГМО
содержат новые гены)
• Определяет количество ГМО %
• Высокая эффективность с широким
спектром пищевых продуктов.
Slide 13
Характеристика полной
системы для анализа ГМО
• Определяет ГМО в соответствии с локальными
и международными требованиями
• Структура и техническое оснащение полностью
соответствуют этим требованиям
– Определяет все ГМО представленные на рынке
– Представляет количественную информацию
– Максимально надежная и воспроизводимая
информация
– Работает с широким диапазоном с/х и пищевых
продуктов
– Включает жесткую программу контроля качества
Slide 14
Критически проблемы при
анализе ГМО
• Нулевая толерантность (качественный
анализ)
– Предел обнаружения (LOD)
– Размер образца
– Специфичность к конкретному виду
• Пороги (количественный анализ)
• Пищевые образцы
• Контроль качества
Slide 15
Нулевая толерантность
(качественный анализ)
Предел обнаружения (0.01%)
Размер образца
Определение вида
Slide 16
Определение LOD для ГМО
% ГМО
Результат
Set
1
Set
2
Set
3
Set
4
Set
5
Set
6
Set
7
Set
8
Set
9
Set
10
Частота
обнаружения
0.02
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10 из 10
0.01
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10 из 10
0.005
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
9 из 10
0.0025
-
+
+
+
+
-
+
+
-
-
6 из 10
0.00125
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0 из 10
Пример:
Кукуруза GA21 10 раз проходила неопределенной через
контролирующие лаборатории!!
Slide 17
Тестирование должно быть
интегрировано с отбором проб, а
лаборатория должна
использовать статистически
достоверные объемы образцов
Slide 18
Пример отбора образца
• Вся мощь ПЦР не может быть раскрыта
с малыми объемами образцов.
• Смесь содержит 0.1% ГМО (1/1000)
• Размер образца = 1000 частиц
– 37% вероятность пропустить ГМО— ложнонегативный!!
• Размер образца = 10,000 частиц
– 99.99% вероятность что ГМО будет
обнаружен.
Slide 19
Образец должен быть
репрезентативным
Партия продукта
Лабораторный образец
3 кг семян (зерна)
Аналитический образец
2 г на дуплекс
Slide 20
Большой гомогенизатор – залог успеха!
Slide 21
Нулевая толерантность
создает проблему
обнаружения ГМО.
Промышленный стандарт
«предела обнаружения» (LOD)
для ГМО 0.01%
Slide 22
Общие элементы
последовательностей
•
•
•
•
•
•
•
•
•
35S Промотор
FMV Промотор
NOS Промотор
Промотор актина риса
35S Промотор
NOS Промотор
E9 Промотор
PIN II Промотор
Другие…
Slide 23
Пороги (количественный анализ):
Риал Тайм ПЦР наиболее аккуратный и
гибкий метод.
Slide 24
ПЦР аккуратно определяет % ГМО
Нужно использовать мультиплексную ПЦР
с детекцией в реальном времени!!
% ГМО определяется по
соотношению генов:
[Копии маркерного гена ГМО в образце]
[Копии маркерного гена культуры в образце]
Slide 25
Количественные методы связаны с
погрешностью измерений.
С целью определять ГМО ниже уровня
установленного для содержания ГМО
законодательством, необходимо работать
существенно ниже порогового уровня.
Slide 26
Образцы продуктов
• Метод экстракции
• Деградация ДНК
Slide 27
Система должна включать
диапазон методов
специфичных к исследуемым
продуктам
• Пищевые продукты содержат ингибиторы
ПЦР.
• Ингибиторы должны быть удалены перед
ПЦР.
• Химический состав разных продуктов и
культур сильно отличается.
• Поэтому методы выделения ДНК должны
подбираться индивидуально.
• Готовые наборы как правило не адекватны.
Slide 28
Наиболее оптимальным методом
выделения ДНК является
использование магнитных частиц
Преимущества:
•Высокая специфичность – ДНК селективно отбирается
на магнитные частицы
•Очень высокий выход ДНК – связывается вся ДНК
•Наилучшая очистка и удаление ингибиторов ПЦР – вымывается всё
кроме ДНК
•Возможность автоматизации - использование разных протоколов
выделения с автоматической системой
•Высочайшая воспроизводимость и надежность – роботизированные
системы исключают ошибку оператора
Slide 29
Методы экстракции должны удалять ингибиторы
находящиеся в сложных пищевых образцах.
В сильно обработанных пищевых образцах
происходит деградация ДНК, что влияет на
общую чувствительность. Поэтому необходимо
дополнительно подтверждать результаты с
использованием положительных контролей.
Slide 30
Контроль качества
• Контроли ПЦР
• Внутренние контрольные образцы
• Тест профессионализма
Slide 31
Все методы анализа должны включать
адекватные контроли
• ПЦР ингибиторы – внутренний контроль.
• Деградация ДНК – положительный контроль и
внутренний контроль
• Постоянный уровень качества—
количественные внешние стандарты
• Ошибки оператора и инструмента
– Дуплекс анализ,
– Множественные ГМО тесты,
– Доступ ко всем данным
• Целостный анализ данных
– Стандартный протокол для анализа данных
– Программы обучения
Slide 32
Выводы
• Анализ ПЦР возможен если присутствует 0.001% ГМО
• Промышленный стандарт для LOD - 0.01% ГМО
• Чувствительность ПЦР эффективна при анализе семян
если используется по меньшей мере 3 кг чтобы
определить 0.01%
• Определение пороговых концентраций требует
использования Риал Тайм ПЦР
• Для законодательно регулируемого порога 0.9%,
рекомендуется определять уровень содержания 0.7%
• Сильно обработанные продукты нуждаются в
дополнительном контроле качества анализа
Slide 33
Логическая схема анализа ГМО
Забор образца
Зона 1
Упаковка в соответствующую тару
Внесение данных об образце в базу
Гомогенизация образца
Отбор аналитического образца в дуплексе
Выделение и очистка ДНК
Определение количества и чистоты ДНК
Расчет эксперимента согласно ТЗ
Подготовка реагентов и праймеров (премикс)
Подготовка (разведение) ДНК и контролей
Смешивание компонентов для ПЦР и запуск
Риал Тайм ПЦР
Сохранение
архивного
образца
Зона 2
Зона 3
Зона 4
ПЦР с анализом по конечной точке
Получение графика амплификации
Анализ данных
Зона 5
Данные приемлемые? Да/Нет
Электрофорез
Ввод данных в базу
Создание отчета
Slide 34
Нормативная база
ДЕРЖАВНІ САНІТАРНІ НОРМИ І ПРАВИЛА
"Організація роботи лабораторій при дослідженні
матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти
I-IV груп патогенності молекулярно-генетичними
методами" Наказ МОЗ №26. 24.01.08
Порядок етикетування харчових продуктів,
які містять генетично модифіковані організми
або вироблені з їх використанням та вводяться в обіг
Постанова КМУ №468 13.05.09
Slide 35
На диске вы также найдете:
Предложение компании «Батик Био Трейд» по комплектации
лаборатории для анализа ГМО
Список необходимого оборудования с ценами
Каталог оборудования для ПЦР лаборатории
Описание наборов для Риал-Тайм ПЦР и праймеров для анализа
на наличие и концентрацию следующих ГМ культур:
• Соя
• Рапс
• Кукуруза
• Сахарная свекла
• Картофель
Описание референсных материалов IRMM для анализа ГМО
в пищевых продуктах
Slide 36
Спасибо за
внимание!
Определение чужеродного
генетического материала в
продуктах питания
Рекомендации
2007
Slide 2
Правильно ли вы определяете ГМО?
Slide 3
Topics of Talk
• Введение
• Основы определения ГМО
• Критические замечания по
определению ГМО
Slide 4
Темы
• Процедура анализа ГМО
– Размер образца и аналитический образец
– Экстракция и очистка ДНК
– ПЦР: Специфичность, LOD и определение
количества
• Контроль качества
– Контроли ПЦР
– Внутренние контрольные образцы
Slide 5
Контроль ГМО и правила
маркировки
Европейская маркировка ГМО и
пороговая толерантность
Маркировка ГМО
0.9%
0.5%
Ноль
Толерантность к контаминация
неизбежными/случайными разрешенными ГМО
Толерантность к не авторизованным безопасным ГМО
контаминациям
Нулевая толерантность к запрещенным ГМО
Slide 6
Кабинет Министров Украины постановлением от 13 мая
2009 г. N 468 « Про утверждение Порядка маркировки
пищевых продуктов, которые содержат генетически
модифицированные организмы или сделанные с их
использованием и вводятся в оборот» установил:
«Етикетування харчових продуктів, які містять генетично
модифіковані організми обсягом понад 0,9 відсотка або
вироблені із сільськогосподарської продукції, вміст генетично
модифікованих організмів у якій становить понад 0,9
відсотка, повинне проводитися їх виробником
(постачальником) із зазначенням відповідної інформації.»
Файл:
Slide 7
Два подхода к
анализу ГМО
Трансген
Нормальная
клетка
Определение
новых генов ПЦР
Определение
новых белков
иммуноанализом
Трансгенная
клетка
Slide 8
Основные принципы ПЦР
• ГМО содержат уникальные
последовательности ДНК
• Ключ к процедуре поиска: “праймера”
• Высокая чувствительность поиска
связанна с процессом умножения в
ПЦР
Slide 9
Распознавание Праймеров
(Реакция гибридизации)
Slide 10
Количество
циклов ПЦР
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
20
30
40
Количество
молекул ДНК
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
1,000,000
1,000,000,000
1,000,000,000,000
Slide 11
Специфичность ПЦР
Подтверждение специфичности праймеров
Образцы 1-10:
Walnut, Hazelnut, Peanut, Pecan, Prune, Apricot,
Nectarine, Pear, Strawberry, Pistachio
Slide 12
Анализ ПЦР
• Высокая чувствительность
• Высокая специфичность
• Работает со всеми ГМО (все ГМО
содержат новые гены)
• Определяет количество ГМО %
• Высокая эффективность с широким
спектром пищевых продуктов.
Slide 13
Характеристика полной
системы для анализа ГМО
• Определяет ГМО в соответствии с локальными
и международными требованиями
• Структура и техническое оснащение полностью
соответствуют этим требованиям
– Определяет все ГМО представленные на рынке
– Представляет количественную информацию
– Максимально надежная и воспроизводимая
информация
– Работает с широким диапазоном с/х и пищевых
продуктов
– Включает жесткую программу контроля качества
Slide 14
Критически проблемы при
анализе ГМО
• Нулевая толерантность (качественный
анализ)
– Предел обнаружения (LOD)
– Размер образца
– Специфичность к конкретному виду
• Пороги (количественный анализ)
• Пищевые образцы
• Контроль качества
Slide 15
Нулевая толерантность
(качественный анализ)
Предел обнаружения (0.01%)
Размер образца
Определение вида
Slide 16
Определение LOD для ГМО
% ГМО
Результат
Set
1
Set
2
Set
3
Set
4
Set
5
Set
6
Set
7
Set
8
Set
9
Set
10
Частота
обнаружения
0.02
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10 из 10
0.01
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10 из 10
0.005
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
9 из 10
0.0025
-
+
+
+
+
-
+
+
-
-
6 из 10
0.00125
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0 из 10
Пример:
Кукуруза GA21 10 раз проходила неопределенной через
контролирующие лаборатории!!
Slide 17
Тестирование должно быть
интегрировано с отбором проб, а
лаборатория должна
использовать статистически
достоверные объемы образцов
Slide 18
Пример отбора образца
• Вся мощь ПЦР не может быть раскрыта
с малыми объемами образцов.
• Смесь содержит 0.1% ГМО (1/1000)
• Размер образца = 1000 частиц
– 37% вероятность пропустить ГМО— ложнонегативный!!
• Размер образца = 10,000 частиц
– 99.99% вероятность что ГМО будет
обнаружен.
Slide 19
Образец должен быть
репрезентативным
Партия продукта
Лабораторный образец
3 кг семян (зерна)
Аналитический образец
2 г на дуплекс
Slide 20
Большой гомогенизатор – залог успеха!
Slide 21
Нулевая толерантность
создает проблему
обнаружения ГМО.
Промышленный стандарт
«предела обнаружения» (LOD)
для ГМО 0.01%
Slide 22
Общие элементы
последовательностей
•
•
•
•
•
•
•
•
•
35S Промотор
FMV Промотор
NOS Промотор
Промотор актина риса
35S Промотор
NOS Промотор
E9 Промотор
PIN II Промотор
Другие…
Slide 23
Пороги (количественный анализ):
Риал Тайм ПЦР наиболее аккуратный и
гибкий метод.
Slide 24
ПЦР аккуратно определяет % ГМО
Нужно использовать мультиплексную ПЦР
с детекцией в реальном времени!!
% ГМО определяется по
соотношению генов:
[Копии маркерного гена ГМО в образце]
[Копии маркерного гена культуры в образце]
Slide 25
Количественные методы связаны с
погрешностью измерений.
С целью определять ГМО ниже уровня
установленного для содержания ГМО
законодательством, необходимо работать
существенно ниже порогового уровня.
Slide 26
Образцы продуктов
• Метод экстракции
• Деградация ДНК
Slide 27
Система должна включать
диапазон методов
специфичных к исследуемым
продуктам
• Пищевые продукты содержат ингибиторы
ПЦР.
• Ингибиторы должны быть удалены перед
ПЦР.
• Химический состав разных продуктов и
культур сильно отличается.
• Поэтому методы выделения ДНК должны
подбираться индивидуально.
• Готовые наборы как правило не адекватны.
Slide 28
Наиболее оптимальным методом
выделения ДНК является
использование магнитных частиц
Преимущества:
•Высокая специфичность – ДНК селективно отбирается
на магнитные частицы
•Очень высокий выход ДНК – связывается вся ДНК
•Наилучшая очистка и удаление ингибиторов ПЦР – вымывается всё
кроме ДНК
•Возможность автоматизации - использование разных протоколов
выделения с автоматической системой
•Высочайшая воспроизводимость и надежность – роботизированные
системы исключают ошибку оператора
Slide 29
Методы экстракции должны удалять ингибиторы
находящиеся в сложных пищевых образцах.
В сильно обработанных пищевых образцах
происходит деградация ДНК, что влияет на
общую чувствительность. Поэтому необходимо
дополнительно подтверждать результаты с
использованием положительных контролей.
Slide 30
Контроль качества
• Контроли ПЦР
• Внутренние контрольные образцы
• Тест профессионализма
Slide 31
Все методы анализа должны включать
адекватные контроли
• ПЦР ингибиторы – внутренний контроль.
• Деградация ДНК – положительный контроль и
внутренний контроль
• Постоянный уровень качества—
количественные внешние стандарты
• Ошибки оператора и инструмента
– Дуплекс анализ,
– Множественные ГМО тесты,
– Доступ ко всем данным
• Целостный анализ данных
– Стандартный протокол для анализа данных
– Программы обучения
Slide 32
Выводы
• Анализ ПЦР возможен если присутствует 0.001% ГМО
• Промышленный стандарт для LOD - 0.01% ГМО
• Чувствительность ПЦР эффективна при анализе семян
если используется по меньшей мере 3 кг чтобы
определить 0.01%
• Определение пороговых концентраций требует
использования Риал Тайм ПЦР
• Для законодательно регулируемого порога 0.9%,
рекомендуется определять уровень содержания 0.7%
• Сильно обработанные продукты нуждаются в
дополнительном контроле качества анализа
Slide 33
Логическая схема анализа ГМО
Забор образца
Зона 1
Упаковка в соответствующую тару
Внесение данных об образце в базу
Гомогенизация образца
Отбор аналитического образца в дуплексе
Выделение и очистка ДНК
Определение количества и чистоты ДНК
Расчет эксперимента согласно ТЗ
Подготовка реагентов и праймеров (премикс)
Подготовка (разведение) ДНК и контролей
Смешивание компонентов для ПЦР и запуск
Риал Тайм ПЦР
Сохранение
архивного
образца
Зона 2
Зона 3
Зона 4
ПЦР с анализом по конечной точке
Получение графика амплификации
Анализ данных
Зона 5
Данные приемлемые? Да/Нет
Электрофорез
Ввод данных в базу
Создание отчета
Slide 34
Нормативная база
ДЕРЖАВНІ САНІТАРНІ НОРМИ І ПРАВИЛА
"Організація роботи лабораторій при дослідженні
матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти
I-IV груп патогенності молекулярно-генетичними
методами" Наказ МОЗ №26. 24.01.08
Порядок етикетування харчових продуктів,
які містять генетично модифіковані організми
або вироблені з їх використанням та вводяться в обіг
Постанова КМУ №468 13.05.09
Slide 35
На диске вы также найдете:
Предложение компании «Батик Био Трейд» по комплектации
лаборатории для анализа ГМО
Список необходимого оборудования с ценами
Каталог оборудования для ПЦР лаборатории
Описание наборов для Риал-Тайм ПЦР и праймеров для анализа
на наличие и концентрацию следующих ГМ культур:
• Соя
• Рапс
• Кукуруза
• Сахарная свекла
• Картофель
Описание референсных материалов IRMM для анализа ГМО
в пищевых продуктах
Slide 36
Спасибо за
внимание!