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EMOSTASI – Parte prima
Per emostasi si intende il meccanismo fisiologico che permette la coagulazione del
sangue per impedirne la fuoriuscita dai vasi (sanguinamento) in assenza di produzione
di trombi patologici.
Alla normale funzionalità di tale sistema concorrono la parete vasale e le piastrine
(emostasi primaria), i fattori della coagulazione (emostasi secondaria) ed i rispettivi inibitori, gli enzimi fibrinolitici con i rispettivi inibitori.
Per essere efficace il “sistema emostatico” deve possedere le seguenti caratteristiche: 1) rapidità di reazione ad un danno della parete vasale; 2) attività limitata alla
durata della emorragia ed alla sede della lesione.
Questi obiettivi sono raggiunti attraverso complesse interazioni che coinvologono
i differenti componenti del sistema emostatico quali vasi, piastrine e proteine plasmatiche.
La risposta emostatica iniziale consiste nella formazione del “tappo piastrinico” nella
sede del danno al fine di arrestare l’emorragia. Tuttavia, quando la lesione coinvolge
i microvasi (capillari, arteriole, venule), la risposta iniziale consiste in una reazione di
vasocostrizione ad opera degli sfinteri precapillari, delle proprietà contrattili delle cellule endoteliali per l’intervento delle catecolamine e della serotonina.


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EMOSTASI – Parte seconda
Dopo questa iniziale risposta contrattile, intervengono le piastrine con le loro specifiche
attività funzionali di adesione ed aggregazione.
Le piastrine sono cellule anucleate e di forma discoide del diametro medio di 2-3 μm.
La loro emivita è di 8-10 giorni. Le piastrine derivano dai megacariociti, cellule multinucleate presenti nel midollo osseo.

A livello ultrastrutturale è possibile distinguere: a) la membrana piastrinica contenente
fosfolipidi (PF3) e diverse glicoproteine che fungono da strutture recettoriali quali la
GPIa (collageno), GPIb (von Willebrand, trombina), GPIIb/IIIa (fibrinogeno, fibronectina, von Willebrand, trombospondina) e GPV (trombina); b) anello di microtubuli,
disposto sotto la membrana, che costituisce la componente contrattile; c) granuli
Presenti nel citoplasma i cui costituenti sono rappresentati da ATP, ADP, serotonina,
calcio (granuli densi) e da β-tromboglobulina (inibitore della PGI2), PF4 (ad effetto
neutralizzante l’eparansolfato), PDGF, FV, fibrinogeno, fibronectina, albumina (granuli
alfa); d) il sistema tubulare denso che contiene la riserva di calcio; e) il sistema canalicolare aperto che è legato alla membrana e che permette di riversare alcuni prodotti
citoplasmatici (costituenti granulari) all’esterno della cellula; f) mitocondri e glicogeno
presenti nel citoplasma per la produzione di energia.


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EMOSTASI – Parte terza
L’endotelio integro non interagisce con le piastrine. Questa proprietà di non “adesione”
può essere spiegata dall’esistenza di forze repulsive tra piastrine e cellule endoteliali e
dalla sintesi, da parte dell’endotelio,di sostanze chemiorepellenti, quali la prostaciclina
o PGI2, che ha funzione inibente l’aggregazione piastrinica e vasodilatante. La produione locale di PGI2 aumenta quando le piastrine attivate entrano in contatto con l’endotelio normale.
Quando l’endotelio è danneggiato, la sintesi di PGI2 cessa nella sede del danneggiamento. Le piastrine, pertanto, possono entrare in contatto diretto con le componenti sottoendoteliali che vengono esposte (collageno) ed aderirvi tramite l’ancoraggio al fattore von Willebrand, sintetizzato dalle cellule endoteliali, mediante un recettore
di superficie denominato GPIb ed al recettore GPIa specifico per le fibrille di collageno.
Alla adesione fa seguito la aggregazione piastrinica che rappresenta il processo attraverso il quale le piastrine si legano tra loro, con un meccanismo energia-dipendente, per
formare il “tappo” emostatico. Durante il processo di adesione appena descritto, le piastrine divengono “attivate”. L’attivazione piastrinica comporta una modificazione morfologica (shape change) dalla forma a disco a piccola sfera con pseudopodi, vengono
esposti i recettori per il fibrinogeno (GPIIb/IIIa), si realizza il rilascio di attivatori endogeni
dai granuli piastrinici (ADP, trombina, TXA2) e gli ioni calcio vengono riversati fuori dal
sistema tubulare denso. Gli attivatori ADP, trombina e TXA2 richiamano le piastrine circostanti formando una massa di dimensioni progressivamente crescenti nota come
“tappo” piastrinico .


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EMOSTASI – Parte quarta
La sequenza delle reazioni intracellulari che mediano l’aggregazione piastrinica si
svolge attraverso un meccanismo comune: l’idrolisi del fosfatidilinositolo della membrana piastrinica da parte della fosfolipasi C.
Questa reazione conduce alla formazione di calcio ionizzato da parte del sistema tubulare denso. La liberazione di calcio ionizzato ha tre conseguenze: 1) formazione
del complesso GPIIb/IIIa sulla membrana piastrinica; 2) attivazione della fosfolipasi
A2 e rilascio di acido arachidonico; 3) secrezione del contenuto dei granuli attraverso
il processo della contrazione piastrinica.
Quando il complesso GPIIb/IIIa si forma, in presenza di ioni calcio, si rende disponibile un sito di legame per il fibrinogeno ed il fattore di von Willebrand. L’aggregazione
piastrinica è mediata da un legame crociato tra piastrine, garantito dal fibrinogeno.
L’attivazione della fosfolipasi A2 di membrana provoca il rilascio di acido arachidonico
dalla membrana piastrinica che, a sua volta, è trasformato in endoperossidi ciclici, attraverso la via della cicloossigenasi, in TXA2, potente agente pro-aggregante.
La liberazione di calcio intracellulare è regolata dalla concentrazione di AMP (adenosina monofosfato). L’AMP inibisce sia l’aggregazione che la degranulazione attraveso
La stabilizzazione del calcio in forma legata. La concentrazione piastrinica di AMP ciclico è la risultante dell’attività dell’adenilato ciclasi, la cui attivazione aumenta la concentrazione di AMPc (trasforma l’ATP in AMP), e della fosfodiesterasi la cui attivazione
riduce la concentrazione di AMPc.


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EMOSTASI - Parte quinta

L’importanza fisiologica, in vivo del fenomeno dell’adesione piastrinica deriva dall’osServazione di un prolungamento del tempo di sanguinamento e di manifestazioni emorragiche nei pazienti con m. di von Willebrand, con sindrome di Bernard-Soulier (assenza congenita di GPIb), con anticorpi anti-GPIb o anticorpi anti fattore von Willebrand, o con assenza congenita di GPIa (recettore collageno).
Le prove dell’importanza fisiologica, in vivo, dell’aggregazione piastrinica derivano
principalmente dall’osservazione di un prolungamento del tempo di sanguinamento e
Dalla presenza di manifestazioni emorragiche in pazienti con tromboastenia di Glanzmann, un raro disordine congenito caratterizzato da una severa diatesi emorragica dovuta ad una assenza parziale o completa del complesso GPIIb/IIIa (recettore fibrinogeno).
Uno degli aspetti più sorprendenti della risposta emostatica è la sua capacità di garantire con rapidità l’apporto del procoagulante richiesto nella sede del danno, in modo da
consolidare il “tappo” piastrinico.
Esistono prove che le piastrine partecipano attivamente al processo della coagulazione,
offrendo una superficie sulla quale avvengono alcune reazioni.
Per esempio l’assemblaggio della protrombinasi (FVa + FXa + calcio + PF3), che genera trombina, avviene sulla membrana piastrinica. Il Fva si lega ad un recettore della suPerficie piastrinica ed il FXa interagisce con il FVa legato alla piastrina. L’ultima tappa
Prevede l’interazione tra protrombina e complesso Va/Xa legato alla piastrina.


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EMOSTASI – Parte sesta

Anche il FVIII si lega ad un recettore di superficie sulla membrana piastrinica. Il FIXa
Reagisce con il FVIIIa legato alla superficie piastrinca. L’ultima tappa prevede la interAzione tra FX ed il complesso FVIIIa/IXa legato alla piastrina.
L’efficienza e la rapidità dell’emostasi sono attribuibili alla presenza di cofattori che accelerano la reazione come il FVIIIa ed il FVa. Durante l’attivazione da contatto sulla superficie piastrinica ed endoteliale la callicreina ed il FXII si attivano reciprocamente.
Analogo meccanismo si verifica tra FXa e FVIIa. La trombina è un enzima chiave che
accelera le varie reazioni della coagulazione, attivando i fattori della via intrinseca
(FXII, FXI, FIX, FVIII, FX) e le piastrine.
L’attivazione dei meccanismi della coagulazione deve essere seguita dalla loro inattivazione, in modo da evitare una inopportuna occlusione vasale o l’esaurimento dei
fattori della coagulazione.
Il controllo dell’intero sistema avviene attraverso i seguenti meccanismi: 1) la diluizione nella circolazione dei fattori attivati e la loro rimozione da parte dei fagociti epatici;
2) il legame della trombina ai suoi recettori, in particolare la trombina si lega alla
Trombomodulina sulle cellule endoteliali ed il complesso trombina-trombomodulina
trasforma la PC in PCa. La PCa vitamina K dipendente per poter agire al meglio
richiede la presenza di un cofattore, la PS, anch’essa vitamina K dipendente.
Il complesso PS/PCa blocca sia il FVa che il FVIIIa; 3) l’inattivazione irreversibile


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EMOSTASI – Parte settima
della trombina e delle altre esterasi ad opera dei loro inibitori. In vivo, i fattori della
coagulazione in forma attivata vengono inattivati da una famiglia di proteasi note
come inibitori delle serinproteasi (serpin). Questa famiglia di proteine comprende
L’antitrombina III, il cofattore II eparinico, il C1 inibitore, l’alfa1- antitripsina, l’inibitore
della PCa, l’alfa2-antiplasmina e l’inibitore del t-PA.
Il FXIIa e la callicreina sono inibiti dal C1 inibitore. Il principale inibitore del FXIa è
L’alfa1-antitripsina. I fattori della coagulazione inibiti principalmente dall’ATIII sono i
fattori XIa, Xa e trombina. L’attività dell’ATIII è aumentata dall’eparansolfato, presente sulla parete vasale e dall’eparina. Il cofattore eparinico II è un’altra serpin che
Inattiva la sola trombina.

Il sistema fibrinolitico, analogamente a quello della coagulazione, viene regolato
dalle serpin per scongiurare una eccessiva attivazione plasminica, che determinerbbe la completa dissoluzione dei trombi emostatici e l’esaurimento del fibrinogeno.
Il sistema febrinolitico è responsabile della rimozione dei depositi di fibrina. L’enzima
principale è la plasmina. Essa deriva da una proteolisi parziale del suo precursore
inattivo, il plasminogeno, ad opera degli attivatori del plasminogeno. Varie proteasi
possono trasformare il plasminogeno in plasmina, tra queste sono inclusi: il fattore
XIIa, la callicreina, il t-PA, l’urochinasi e la streptochinasi.
L’inibitore della plasmina è in primo luogo la alfa1-antiplasmina. I tre inibitori del t-PA
sono il PAI1, il PAI2 ed il PAI3. Di recente acquisizione è il TAFI (Thrombin Activatable
Fibrinolysis Inhibitor).


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EMOSTASI – Parte ottava
L’importanza del sistema fibrinolitico in vivo è dimostrata da quanto si osserva in
alcune patologie.
Il deficit congenito di alfa2-antiplasmina provoca diatesi emorragica dovuta alla
mancanza di qualsiasi limitazione all’azione della plasmina. Alcune anomalie di
Questo sistema possono anche predisporre allo sviluppo di tromboembolia venosa,
tra queste: la displasminogenemia e la ipoplasminogenemia congenite, un ridotto
rilascio di t-PA, un aumentato livello di PAI1.
Ruolo dell’endotelio: la parete endoteliale presenta molte caratteristiche strettamente
correlate al controllo della risposta emostatica. Come già discusso, la tappa iniziale
dell’adesione e della attivazione piastrinica prevede il legame al subendotelio .
L’endotelio, inoltre, esplica un’attività procoagulante attraverso il rilascio del fattore
tessutale ed un’attività anticoagulante tramite il rilascio del TFPI (Tissue Factor
Pathway Inhibitor).
L’endotelio ha proprietà antitrombotiche grazie al sistema trombomodulina/PC ed alla
presenza di eparansolfato sulla sua superficie.
Infine, l’endotelio prende parte alla risposta fibrinolitica mediante il rilascio dell’ t-PA.
E’ possibile che queste funzioni dell’endoltelio prevengono la propagazione della risposta emostatica oltre la sede del danno vascolare.


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Classificazione delle malattie delll’emostasi
A) Alterazione del fattore vascolare
1) porpora allergica o anafilattoide (m. di Schonlein-Henoch)
2) porpora non allergica
3) Teleangectasia ereditaria emorragica (m. di Rendu-Osler)
B) Alterazione del fattore piastrinico
1) da modificazioni del numero
a) trombocitopenie da difetto di produzione
b) trombocitopenie da eccesso di distruzione (PTI)
c) trombocitopenie da ipersequestro
2) da anomalie qualitative
a) congenite (Bernard-Soulier e Glanzmann)
b) acquisite
C) Alterazioni del fattore plasmatico
a) congenite (Emofilia)
b) acquisite
D) Sindrome da coagulazione intravascolare disseminata (CID)
E) Alterazioni della fibrinolisi


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Sindromi Emofiliche

Emofilia A = deficit FVIII
Emofilia B = deficit FIX
Emofilia C = deficit FX
EMOFILIA

A

Il FVIII è una glicoproteina ad alto peso molecolare sintetizzata nelle cellule
endoteliali e nei megacariociti come FVIII antigene, ed a livello epatico come
FVIII a capacità procoagulante.
IL FVIII circolante non è un’unica e semplice molecola bensì un “polimero”, cioè
un aggregato di sub-unità, per il quale è utilizzato il termine di FVIIII complesso.
Gli studi sulla struttura aggregativa molecolare del FVIII-complesso hanno perMesso di stabilire 2 principali componenti: una a basso peso molecolare (Low
Molecular weight – LMW) avente attività pro-coagulante (le cosidette “smaller
forms”) ed una a più elevato peso molecolare (High molecular weight – HMW)
(le cosidette “larger forms”) aventi la proprietà di favorire l’adesione delle piastrine
al sub-endotelio ed a superfici non biologiche, di aggregare le piastrine in presenza di ristocetina e di presiedere all’emostasi primaria (tempo di sanguinamento).


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EMOFILIA

A – Parte seconda

La componente del FVIII complesso avente carattere antigenico (FVIII:Ag) corrisponderebbe a quella che funzionalmente esplica effetto adesivante ed aggregante le piastrine.
Per tutte queste capacità il FVIII:complesso può definirsi un cofattore plasmaTico delle piastrine.
In definitiva, per quanto riguarda le principali attività funzionali del FVIII
plasmatico, è stato stabilito che tale fattore possiede le seguenti proprietà:
1) FVIIII:C – componente del FVIII ad attività procoagulante;
2) FVIII:Ag – componente del FVIII che partecipa in presenza di antisiero antiFVIII umano di ratto;
3) FVIII:vW – componente del FVIII che presiede all’emostasi primaria (tempo
di emorragia) ed allo svolgersi dell’adesività piastrinica.
L’emofilia A è una malattia emorragica congenita dovuta al deficit del FVIII:C
con conseguente deficit di formazione di protrombinasi (Fva+Fxa+Ca+PF3)
nella via intrinseca della coagulazione.
La ereditarietà e di tipo diaginico: la donna è portatrice del difetto genico.
La donna portatrice può essere distinta con certezza dalla donna normale in
Base al dosaggio del FVIII:C e del FVIII:Ag. Nel soggetto normale il rapporto
VIII coagulante/VIII antigenico è uguale all’unità. Nella portatrice di emofilia A
Tale rapporto è sempre nettamente inferiore all’unità.


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EMOFILIA – Parte terza

Femmina Portatrice
Inattivazione casuale X
(Legge di Lyon)
Inattivazione bilanciata = VIII ~50%
Inattivazione prevalente Xe = VIII >50%
Inattivazione prevalente X = VIII < 50%
Genetica della Emofilia
Donna portatrice e uomo sano = 25% di maschi sani, 25% di donne sane, 25%
di uomini malati, 25% di donne portatrici
Donna normale e uomo malato = maschi sani e donne portatrci
Donna portatrice e uomo malato = 25% donne portatrici, 25% uomini malati,
25% uomini sani, 25% donne malate


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EMOFILIA A – Parte quarta
Ipotesi della Lyon (inattivazione casuale del cromosoma X)
Dopo un certo numero di divisione mitotiche successive alla formazione dello zigote,
Uno dei due cromosomi X viene inattivato. Poiché tale inattivazione si verifica a caso,
Si possono avere o molte cellule produttrici di FVIII con il cromosoma attivo “emofilico”
(Xe), o molte cellule produttrici di FVIII con il cromosoma attivo normale (X). Pertanto, la
femmina nel secondo caso sintetizza FVIII come una persona normale. Ne deriva
che la femmina portatrice non può essere distinta con certezza dalla femmina normale in base al dosaggio del FVIII.
per effettuare tale distinzione occorre dosare contemporaneamente il FVIII “coagulante” ed il FVIII “antigenico”. Nel soggetto normale il rapporto VIII coagulante/VIII
antigenico è uguale all’unità. Nella portatrice di emofilia tale rapporto è sempre nettamente inferiore all’unità.


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EMOFILIA – Parte quinta
Classificazione clinico-laboratoristica
La sintomatologia clinica è caratterizzata dagli emartri (anca, ginocchio, caviglie,
gomito) e dagli ematomi (versamenti ematici sottocutanei, sottofasciali, intramuscolari). Questi ultimi possono essere pericolosi se comprimono organi vitali (ematomi del collo o in sede peritoneale). Possono verificarsi emorragie dell’apparato
digerente ed urogenitale.
La sintomatologia clinica (frequenza e severità) dell’emofilia A è proporzionale alla
Quantità di fattore VIII “coagulante” presente.
-Emofilia grave: fattore VIII 0-2% del normale. Emartri ed emorragie spontanee
frequenti e gravi. Tempo di coagulazione (PT) e PTT allungati.
-Emofilia intermedia: fattore VIII 2-5% del normale. Emartri ed emorragie spon(o moderata)
tanee non frequenti e non gravi. Emorragie chirurgiche o
traumatiche gravi. Tempo di coagulazione normale e PTT
allungato.
Emofilia lieve: fattore VIII 5-25% del normale. Emartri ed emorragie spontanee rare. Emorragie chirurgiche o traumatiche gravi. Tempo di coagulazione normale e PTT lievemente allungato o normale.


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EMOFILIA – Parte sesta
Terapia sostituiva: infusione dei concentrati di FVIII ricombinante.
Nelle forme di emofilia A lieve si può utilizzare la desmopressina (DDAVP) per la
capacità di dismettere il fattore VIII dai depositi endoteliali (corpi di Weil Palade).
In corso di terapia sostitutiva, il 25-50% di pazienti con emofilia severa possono
presentare positività per anticorpi anti-FVIII (IgG4) responsabili della proteolisi del
FVIII. La maggior parte degli inibitori sono di “tipo 1” (inattivazione lineare con
proteolisi completa del FVIII); solo in una minoranza di casi gli anticorpi sono di
“tipo 2” (inattivazione non lineare con proteolisi incompleta del FVIII). Il titolo degli
Inibitori è testato mediante il metodo Bethesda (questa analisi riflette la capacità
di inattivare il 50% del FVIII aggiunto al plasma del paziente) o il metodo New
Oxford (Regno Unito).
In tale condizione si utilizzano i concentrati di complesso protrombinico o
il FVII ricombinanate.
Terapia genica: utilizzo di vettori virali (adenovirus) che integrano il loro genoma,
che porta il gene per il FVIII, nel genoma umano per la sintesi di fattore VIII di origine epatica.
Esiste una “tossicità” da vettore secondaria alla interazione vettore/sistema imMunitario con formazione di anticorpi anti-FVIII (presenza di geni virale all’interno
del vettore) o per il rischio di trasformazione neoplastica.
La tossicità del vettore virale di “prima generazione” è superabile con l’utilizzo
di vettori virali di “seconda generazione” mancanti di tutti i geni virali e ad attività
extra cromosomica.
Al momento la terapia genica è stata valutata su modelli animali (cane, topo, maca-


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M. di von Willebrand

La m. di von Willebrand è una coagulopatia erediitaria caratterizzata dal deficit del
FVIII:Ag/vWF. La carenza congenita del FVIII:Ag/vWF rende inadeguata la interazione GPIIb/IIIa e GPIb piastrinica e parete endoteliale con conseguente riduzione
della adesione piastrinica. Ne deriva una sintomatologia emorragica di tipo cutaneomucoso.
Questo disordine emorragico viene attualmente classificato in 3 tipi: il tipo 1° e 3°
configurano un difetto quantitativo del FVIII:Ag/vWF; il tipo 2° configura un difetto
qualitativo/funzionale del FVIII:Ag/vWF. Nel tipo 2 si riconoscono un sottotipo 2A,
caratterizzato dalla totale assenza dei multimeri del vWF e ridotta aggregazione
con Ristocetina ed il sottotipo 2B caratterizzato da aumentata risposta aggregativa alla Ristocetina. Il meccanismo patogenetico della emorragia nei pazienti 2B
potrebbe trovare una plausibile spiegazione in un sofisticato studio sullo sviluppo
del trombo mediante una tecnica di microscopia a laser. Che mostra una significaTiva riduzione del trombo murale, sebbene si verifica l’iniziale adesione piastriInica.

Il laboratorio prevede l’esecuzione del tempo di sanguinamento che sarà allungato;
Gli esami emocoagulativi di base saranno nella norma.