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PCR-Methoden
SSP- und SSO-PCR
Guido Heymann


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PCR-Methoden


PCR-SSP

Sequenzspezifische
Primer erkennen einzelne
Allele während der
Amplifikation



PCR-SSO

Sequenzspezifische
Oligonukleotide erkennen
einzelne Allele in einem
zweiten Schritt nach der
Amplifikation
vorgegebener DNAAbschnitte


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PCR-SSP
(sequence specific primers)







Genomische oder kodierende DNA eingesetzt
Sense- und Antisenseprimer amplifizieren
definiertes Stück DNA
Ein Primer detektiert ein vorgegebenes Allel
spezifisch, wenn am 3´-Ende ein Basenmismatch
vorhanden ist, findet keine Amplifikation statt
Am Ende der Amplifikation ist eine direkte
Auswertung z.B. über ein Gelbild möglich


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Prinzip der PCR-SSP
Genomischer DNA-Doppelstrang bei
Erhitzung auf >92°C denaturiert.


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Prinzip der PCR-SSP
Primerannealing bei 37 - 72°C
5´
Antisenseprimer

3´
3´
Senseprimer

5´


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Prinzip der PCR-SSP
Primerannealing mit Basenmismatch
5´
Antisenseprimer

3´
Senseprimer
Da Mismatch
keine Elongation
5´

3´


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Prinzip der PCR-SSP
Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C
Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elongation, bis PCR-Cyclen beendet.
5´
3´
3´
5´


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PCR-SSO
(sequenz specific oligonucleotides)

Genomische oder kodierende DNA
 Primerpaar amplifiziert größeres DNAStück, das spezifische Areale umfaßt.
 In einer Detektionsreaktion werden mittels
spezifischer DNA-Sonden verschiedene
Allele erkannt und in einer zweiten
Reaktion dargestellt (Farbumschlag,
radioaktiv...)



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Prinzip der PCR-SSO


Dot-Blot-PCR-SSO: PCR-amplifizierte
Ziel-DNA wird auf Trägermedium immobilisiert; spezifische Oligonukleotide
werden stellenweise aufgetragen; wo
spezifische Anlagerung geschah, wird durch
Reportermolekül Nachweisreaktion
vermittelt.


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Prinzip der PCR-SSO

Markiertes
Oligonukleotid
z.B. DIG,Biotin
......

Reportermolekül
mit Antikörper gegen DIG
oder Streptavidin
radioaktiv oder enzymvermittelte Farbreaktion

Ziel-DNA

Auf Membran fixiert


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Prinzip der PCR-SSO


Reverse-Dot-Blot-PCR-SSO: Spezifische
Oligonukleotide werden auf Trägermedium
immobilisiert; PCR-amplifizierte ZielDNA, die während der Elongation mit
einem Labelmolekül versehen wurde, wird
stellenweise aufgetragen; wo spezifische
Anlagerung geschah, wird durch
Reportermolekül Nachweisreaktion
vermittelt.


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Prinzip der PCR-SSO

Strepavidinkonjugiertes
Reportermolekül
macht Bindung
sichtbar
(radioaktiv,
enzymatisch..)

Ziel-DNA wird mit
biotinmarkierten Primern
amplifiziert und denaturiert auf die Membran
gegeben

SSO-Moleküle
werden auf Membran
immobilisiert
(mit Poly-T oder
BSA)


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Prinzip der PCR-SSO


PCR-Oligocapture sandwich assay :
Spezifische Oligonukleotide werden an
Trägermedium immobilisiert und PCRamplifizierte Ziel-DNA wird ansatzweise
dazugegeben; danach wird ein Oligonukleotid, das eine hochkonservierte Region
erkennt, dem Ansatz hinzugefügt. Dieses
Reporter SSO vermittelt die Nachweisreaktion.


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Prinzip der PCR-SSO
Im letzten Schritt wird das
Substrat, z.B. O-phenylenediamin, als Farbreaktion
umgesetzt

Capture Oligonukleotid ist
an Wand des
Reaktionsgefäßes
fixiert

Detektionsoligonukleotid ist mit
Enzym gekoppelt,
das Substratumwandlung vermittelt
PCR-amplifizierte DNA
bindet an fixiertes SSO


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Prinzip der PCR-SSO


PCR-Dual phase Oligocapture assay :
In der flüssigen Phase wird die Ziel DNA
während der PCR mit Digoxigenin markiert
und ansatzweise mit biotinmarkierten SSOs
hybridisiert. In der festen Phase wird diese
Bindung in streptavidinbeschichteten
Reaktionskammern fixiert und über AntiDIG-Ak als Reaktionsmittler die Bindung
dargestellt.


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Prinzip der PCR-SSO
4
Das Reportermolekül
reagiert mit den an die
DNA konjugierten
Labelmolekülen.

1
In der vorgeschalteten flüssigen Phase wird die ZielDNA amplifiziert und mit
speziellen Molekülen,
z.B. DIG, markiert.

5
Es findet eine
enzymatische
Farbreaktion
statt.

3
Das Gemisch wird
in streptavidinkonjugierte Wells
einer Mikrotiterplatte eingefüllt.

2 Die Ziel DNA wird mit biotinylierten
SSO-Sonden hybridisiert.


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PCR-Fakten
Die tatsächliche Effizienz der PCR liegt
üblicherweise bei 70-80%.
 Nach etwa 35 Zyklen wird ein Plateau
erreicht:


–
–
–
–
–

Anstieg der Schmelztemperatur
Reannealing in Konkurrenz zur Primeranlagerung
Abnahme der Primerkonzentration
Hitzestreß auf Taq-Polymerase (T1/2 bei 95°C 40 Min.)
3´-5´-Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase


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Reaktionsparameter


PCR-Primer:
–
–

–
–
–
–
–

ab 18 nt Länge ausreichende Spezifität
ab 28-30 nt keine Zunahme der Spezifität
GC-Gehalt zwischen 50-60%
ähnliche Schmelztemperaturen
Poly-T-Reste neigen zu unspezifischen
Bindungen
palindromische Bereiche führen zu
Haarnadelbildungen
Interprimerkomplementarität erzeugt Dimere


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Reaktionsparameter


Desoxynukleosidtriphosphate:
–
–
–

pH 7,0
Taq-Polymerase arbeitet bei niedrigeren dNTPKonzentrationen genauer
üblich 20-200µM je dNTP


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Enzymkonzentration
Für 100 µl Ansatz 1 - 2,5 U Enzym
 Zu viel Enzym erzeugt Unspezifitäten
 Zu wenig Enzym verringert Produktausbeute



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Andere Einflußfaktoren
Qualität der DNA-Matrize
 PCR-Puffer:


–



Tris-HCL, NH³/KCL...

Magnesiumchlorid
–
–

über dNTP-Konzentration, da dNTPs Mg
wegen negativer Ladung binden
Auswirkung wie bei Enzymkonzentration


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PCR-Förderer und -Inhibitoren
Glycerin: erhöht T 1/2 von Taq-Polymerase
 DMSO: löst störende Sekundärstrukturen
der Matrize auf, hemmt Taq
 Heparin: hemmt Taq-Polymerase
 EDTA: kann Mg wegfangen
 Häm: Fe hemmt Taq
 Detergenzien: können PCR hemmen
