Transcript Microscopie confocale à balayage laser

Microscopie confocale
à balayage laser
Romain Morichon
IFR 65 Site St Antoine
Principe microscope confocal
Marvin Minsky
Informaticien et roboticien américain
Créateur de l’intelligence artificielle et le père du confocal
(1957)
Structure des plateformes
•Plateformes d'imagerie cellulaire
Font partie de l'IFR 65
•Regroupement 15 équipes INSERM, 10 équipes
d'accueil P6.
-Plateforme Tenon
- 1 SP1 Leica (1998), 200K€
-1 SP2 Leica (2004) + Multiphoton (2006), 450K€
-Plateforme St Antoine
-1 SP2 Leica (2012)
-1 Spinning disk (2008) 350K€
GFP
Principe microscope confocal
Au niveau de l’échantillon
Exemple
Cellule Hela
Epifluorescence
Microtubule
Confocal
F-Actine
Noyaux
Résolution
• Microscopie conventionnelle
dxy = 0,61./ON
dxz= 2./ON2
• Microscopie Confocale
dxy = 0,4./ON
dxz= 1,4./ON2
Gain :
15% en latérale
30% en axiale
Exemple : 100X 1,4ON à 488nm
Conventionnelle:
dxy= 210nm
dxz= 500nm
Confocale
dxy= 140nm
dxz= 350nm
Quelques exemples de confocal
Zeiss LSM 710
Nikon A1+
Leica SP5
Olympus FLUOVIEW 1000
Leica SP5
LASER
AOTF
LASER comme source de lumière
• Source lumineuse monochromatique
intense
• Différents types de LASER:
– Ar 457nm, 488nm, 514nm
– ArKr 488nm, 568nm, 647nm
– HeNe 543nm
– HeNe 633nm
– Diodes 405nm ou 488nm ou 561nm…
Choix des Fluorochromes
514nm
Alexa 568
543nm
Alexa 568
561nm
Alexa 568
Choisir les fluorochromes en fonction
des lasers disponibles.
Plus l’excitation sera loin du maximum
d’absorption plus l’émission sera
faible.
AOTF
L’interaction entre la lumière et une onde
acoustique produit une diffraction de la
lumière.
A partir d’une fréquence acoustique
donnée on sélectionne une longueur d’onde.
Possibilité de sélectionner jusqu’à 8 raies
et d’en moduler leurs intensités
Laser 1
Laser 3
Laser 4
Laser 5
Laser 2
Leica SP5
AOBS
AOBS vs Dichroique
Permet de supprimer les filtres
dichroïques classiques qui ont des
caractéristiques fixes et une bande passante
faible.
possède une grande flexibilité et une
meilleure efficacité
permet de réduire la puissance de laser
tout en réalisant des acquisitions plus
rapides
permet de contrôler jusqu'à 8 raies lasers
de façon séquentielle ou simultanée.
Courbe de transmission
Leica SP5
Système de balayage XY
Système de balayage Z
Balayage XY
Effectué par 2 miroirs orientés par
des moteurs galvanométriques ou
résonnants
Balayage x en continu
Balayage y incrémenté
Vitesse de balayage 200, 400, 800
ou 1000 Hz pour un galvanomètre
linéaire et jusqu’à 8000Hz pour un
résonnant.
GSI Lumonics
OSS 2500
1
2
1
Uni
2 Bi
Vitesse de balayage
Balayage Z
• En bougeant l’objectif
– Z drive: grande amplitude, précision 10nm
– Objectif piezo: faible amplitude (400µm),
grande précision (n)
• En bougeant la platine
– Piezo: faible amplitude (500µm), grande
précision (nm)
– Galvo: grande amplitude (1,5mm), grande
précision (10nm)
Leica SP5
Pinhole
Pinhole
Confocal
Non confocal
ouverture du pinhole
d < 0.7AU
Diamètre d’ouverture faible
d > 1AU
Diamètre d’ouverture élevé
-> Section optique fine
-> Section optique épaisse
=résolution Z élevée
=résolution Z faible
=Signal récupéré faible
=Signal récupéré élevé
Pinhole optimisé pour chaque objectif à 1AU
Leica SP5
Système de détection
Prisme/fente spectrale
PMT
PMT
PMT
PMT
PMT
PMT
PMT
Rendement 40%
Photodiode
Rendement 80%
Gain et offset
Gain: Amplifie le signal d’entré -> luminosité de l’image augmentée
Offset: Permet d’enlever le bruit fond de l’image
Lut « glow over/under »
Effet de saturation
Épaisseur=0,85µm
Épaisseur=1,35µm
Image
Chaque pixel (picture element) a une coordonnée et une valeur d’intensité.
Format de l’image 512x512, 1024x1024, 2048x2048…
Pour du qualitatif -> Intensité codée sur 8 bits (256 niveaux de gris)
Pour du quantitatif -> Intensité codée sur 12 bits (4096 niveaux de gris)
L’œil ne perçoit que 30 à 40 niveaux de gris
Résolution
La capacité d’un système optique à distinguer deux points distincts.
Combien de pixel ais je
besoins pour reproduire
l’objet avec la meilleur
résolution?
-> Critère de Nyquist
Pas d’échantionnage = r/2,3
1024X1024
256X256
Exemple:
Zoom
Objectifs
Longueur d’onde
(nm)
ON
Rxy
(nm)
Taille du pixel
(nm)
512x512
1024x1024
2048x2048
63X
500
1,4
160
70
4X
2X
1X
Moyennage
Sans
2X
8X
Fait la moyenne arithmétique de chaque valeur d’intensité de chaque pixel
Amélioration du rapport signal/bruit
Moyennage par ligne utilisé pour expérimentation sur le vivant
Accumulation
Sans
2X
4X
Les valeurs d’intensités mesurées sont additionnées pour chaque point de
balayage
=> Permet d’augmenter le signal en cas de marquage faible
Zoom
Une zone plus petite est scannée avec le même
nombre de pixels -> la résolution reste constante,
Les détails sont augmentés
Zoom 1
Zoom 2
Zoom 4
Multimarquage
Attention au chevauchement de spectres
Acquisition simultanée
488 + 568
a = Anti RF(Alexa 488)
b = C12 Bodipi 568
c = Merge
a
b
c
Acquisition séquentielle
488 puis 568
d = Anti RF(Alexa 488)
e = C12 Bodipi 568
f = Merge
d
e
f
PMT 2
Acquisition séquentielle si utilisation de 2 fluorochromes proches!
Acquisition
Acquisition de 80 images à 200nm
d’intervalle en 1024x1024
sections
optiques
Cellule MDCK
Projection
Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3
Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire
Reconstruction 3D
Coupe XZ
Cellule MDCK
Vert Alexa 488 marquage
de la protéine MDR3
Coupe XY
Coupe XZ
Rouge Iodure de propidium
marquage nucléaire
Accumulation apicale de
MDR3
Co-localisation
A anti-FLAG M2 Alexa Fluor 546
B anti CD-3 / Alexa Fluor 633
C Merge
Time Laps
-Cellules MA104
-Sonde Calcium MC164 cagée
-Sonde desestérifiée dans
cellule, devient fluo quand
fixée au Ca
-Acquisition toutes les 10
secondes de 5 coupes
Applications
Microscope confocal biphoton
GFP : 1 photon à 488nm
2 photons à 960 nm…
Confinement de l’excitation laser -> pas de pinhole -> moins de photons perdus
Grande profondeur d’observation (jusqu’à 300µm)
Pas de photoblanchiement hors du plan focal
Préservation
échantillon
Résolution
Rapidité
Multicouleurs
Échantillon
épais
Microscope
confocal
-
++
-
++
+
Microscope
Biphoton
++
++
-
+
++
Spinning disk
+
++
++
+
+
Apotome
-
+
-
+
+
Vidéo
microscope
++
+
++
+
+
Merci à tous pour votre attention