Transcript sterilt är inte nog

Få känner till att det finns en koppling mellan medicintekniska produkter och ett uråldrigt havsdjur.
Dolksvansarnas unika blod fungerar
som ett effektivt och superkänsligt
test för endotoxiner, bakteriegifter,
som kan orsaka hög feber och i värsta fall död, om de kommer in i blodomloppet genom förorenade produkter.
TEXT: MARIE OLSSON, CERTIFIERINGSCHEF FÖR MDD PÅ INTERTEK
STERILT ÄR
INTE NOG
Ibland räcker det inte att en produkt är steril för att
skydda en patient. I vissa fall kan produkten ändå orsaka
allvarliga komplikationer såsom hög feber, chockreaktion
och dödsfall. Det kan hända om det finns endotoxiner
på produkten, och de sedan förs in i blodomloppet eller i
det lymfatiska systemet.
Endotoxin är ett pyrogen som kommer från en stor
grupp vanligt förekommande bakterier, de så kallade
gramnegativa bakterierna. Redan mycket små mängder
av detta kraftfulla pyrogen kan orsaka allvarliga reaktioner då det aktiverar immunförsvaret. Pyrogen är ett
samlingsnamn för alla ämnen som kan framkalla en
feberreaktion hos däggdjur om de kommer in i kroppen
genom en infektion eller en injektion. Både läkemedel
och medicintekniska produkter måste därför kontrolleras
för pyrogener. Det är i huvudsak endotoxiner som är aktuella, men för vissa läkemedel kan även andra pyrogener
vara ett problem.
Endotoxin - (nästan) oförstörbart
Endotoxiner är en komponent i cellväggen hos alla
gramnegativa bakterier. Denna molekyl kallas för LPS,
lipopolysackarid, eftersom den består dels av en fettlöslig
del (lipid) och dels av två sockermolekyler (poly-sackarid).
LPS-molekylen sitter i cellväggen med lipiddelen in mot
cellens inre, och poly-sackariden utåt mot omgivningen
utanför bakterien. Det är lipiddelen som orsakar den toxiska reaktionen. Så länge cellen lever är denna del gömd,
men om cellen skadas eller dör och cellmembranet bryts
ned, exponeras endotoxinet mot omgivningen.
Endotoxin är en väldigt motståndskraftig molekyl.
Vanliga rengöringsmedel eller steriliseringsmetoderna
autoklavering, strålning eller etylenoxid påverkar den inte.
Den kan inte heller avlägsnas med sterilfiltrering. Det som
krävs för att avlägsna endotoxiner är temperaturer på
över 200 grader i uppemot en timme, vilket få produkter
klarar. Eftersom det är så svårt att avlägsna pyrogener
måste man istället se till att minimera mängden endotoxin hos produkten under tillverkningsprocessen. Beteckningen ”pyrogenfri” betyder inte att produkten är helt
fri från endotoxiner, det betyder bara att nivån är mycket
låg, att den ligger under ett fastställt gränsvärde.
Kritiska produkter
De produkter där nivån på endotoxin är kritisk, är intravenösa läkemedel och medicintekniska produkter som
är i kontakt med det cirkulatoriska eller det lymfatiska
DOLKSVANSEN samlas in och transporteras till laboratorier där
de tappas på runt en tredjedel av sitt blod. Sedan släpps de ut i
havet igen. Detta havsdjurs blod används för att framställa test
för endotoxiner.
4
MEDTECH INFO 2-2011
Tre tekniker
Testningen för endotoxiner görs oftast i specialiserade
laboratorier. Man använder testet LAL (Limulus Amebocyt
Lysat) som finns i lite olika varianter. I sin enklaste form
tillsätts LAL-reagens till provet i provröret, varpå det inkuberas i 37 grader i en timme och sedan försiktigt vänds
upp-och-ner. Om ett gel eller ”klot” (gelklot-metoden)
har bildats, så är provet positivt för endotoxiner.
Metoden har vidareutvecklats. Europeiska farmakopén beskriver tre tekniker (gelklot, turbidimetrisk och
kromogenisk) för LAL som används i sex olika metoder.
Gelklot-metoden är den enklaste, de andra är mer avancerade och kräver mer komplicerad analysutrustning.
Det är viktigt att komma ihåg att validera tillförlitligheten
och noggrannheten för den valda LAL-metoden för varje
produkttyp som ska testas.
Alla metoder kräver att testreagens, behållare, pipetter och liknande är pyrogenfria. Torrsterilisering kan användas (250 grader i 30 min). I farmakopén beskrivs hur
testlösningen framställs och hur testerna genomförs.
Foto: Andrey Malov
systemet, samt med ryggmärgsvätska. Det inkluderar
produkter där kontakten är indirekt, exempelvis genom
att vätska eller blod passerar eller kanaliseras genom
produkten tillbaka in i kroppen, exempelvis intravenösa
katetrar, dialysatorer och dialysslangar med tillbehör,
hjärtklaffar, kärlgrafter (vascular grafts), intramuskulära
katetrar för läkemedelstillförsel samt transfusion- och
infusionsset. När det gäller slangset brukar det vara just
“vätskekanalen” (fluid path) som kontrolleras.
Amerikanska farmakopén bestämmer gränsvärden
för medicintekniska produkter (USP27). Det är satt
till < 20 Eu (endotoxin units) per produkt för de mest
kritiska produkterna, och ännu
lägre för produkter som kommer
i kontakt med ryggmärgsvätskan cerebrospinal fluid, 2.15
Eu. Gränsvärdet för vatten för
injektionsvätskor, sterilt vatten
intravenöst och sterilt vatten för
sköljning preciseras
Paradoxalt nog
till < 0.25 Eu/ml.
är det framför allt
Där det finns
renat vatten som
bakterier finns det
också endotoxiner.
kan ge höga halter
Även om bakteendotoxin.
rier i luften och
på ytor kan ge en
mindre mängd endotoxiner, är det framför allt i vatten
som endotoxinnivån kan bli hög. Paradoxalt nog är det
framför allt renat vatten som kan ge höga halter endotoxin. Det beror på att man i renat vatten tagit bort alla
föroreningar, även kloreringen, som normalt begränsar
bakterietillväxten. Om vatten ingår i tillverkningsmiljön, är
det viktigt med noggrann design, underhåll och kontroll
av vattensystemet.
INTRAVENÖSA LÄKEMEDEL och medicintekniska produkter
som är i kontakt med det cirkulatoriska eller det lymfatiska
systemet, samt med ryggmärgsvätska är exempel på produkter
där nivån på endotoxin är extremt viktig.
Dolksvansen en unik blodgivare
LAL-reagenset kan inte framställas på syntetisk väg. För
att framställa det är man beroende av blod från en unik
blodgivare, dolksvansen. Detta havsdjur samlas in och
transporteras till laboratorier där de tappas på runt en
tredjedel av sitt blod. Sedan släpps de ut i havet igen. Ur
blodet utvinner man de komponenter som behövs för
LAL-reagenset.
Dolksvansens blod skiljer sig från vårt på många sätt.
Dels har dolksvansarna ingen motsvarighet till våra röda
blodkroppar; syret binds istället till hemocyanin, deras
motsvarighet till vårt hemoglobin, som cirkulerar fritt i
plasman. Istället för järn har hemocyanin koppar, vilket
gör att blodet blir blått i kontakt med syre, exempelvis
när djuret skadas eller tappas på blod. Blått blod är vanligt hos leddjur, den grupp som dolksvansarna tillhör.
Endast en cell i blodet
Dolksvansen har bara en enda cell i blodet – amebocyten.
Den kombinerar uppgifter för koagulering och immunförsvar. När amebocyterna aktiveras av till exempel en
sårskada, så ändrar de form. De får utskott, blir kladdiga och klumpar lätt ihop sig, och utsöndrar även olika
MEDTECH INFO 2-2011
5
Foto: Robin O´Connell
DOLKSVANSARNA ÄR HAVSLEVANDE djur som föredrar mjuka, sandiga eller leriga bottnar på kontinentalhyllan. De kan ses på
sandiga stränder dit de tar sig för att para sig och lägga ägg.
försvarsämnen. Såret tätas med en propp som består av
en mängd hopklumpade celler i en gelé som de själva
utsöndrar. Amebocyterna kan också omsluta och ”svälja”
främmande partiklar för att oskadliggöra dem. Även
när bakterier med endotoxiner tränger in i dolksvansens
kropp, aktiveras amebocyterna. De utsöndrar ämnen som
levrar blodet runt bakterierna, kapslar in dem och dödar
dem innan de kan sprida sig vidare.
Detta speciella immunförsvar upptäcktes av Dr Loeb i
början av förra seklet, men det var först under 60-talet då
forskarna Levin och Bang upptäckte att det var just endotoxinet som satte igång kedjereaktionen som gjorde att
DOLKSVANSARNA
är de närmast levande
släktingarna till de
uråldriga trilobiterna,
och till stora delar har
de varit oförändrade
över 200 miljoner år,
och därför kallas de
för ett levande fossil.
6
MEDTECH INFO 2-2011
dolksvansens blod levrade sig. Nu kunde man dra praktisk nytta av upptäckten. Levin och Bang lyckades utvinna
koaguleringsämnena ur amebocyterna. De hade nu hittat
en lösning som kan användas som en känsligt test för endotoxin. Om det finns endotoxin så koagulerar lösningen
direkt. Blandningen av koaguleringsämnen kallas LAL
och testen kallas limulustest (efter Limulus polyphemus,
den amerikanska arten av dolksvansar). Testen är extremt
känsligt och reagerar på ytterst små mängder endotoxin.
Endotoxintest
Man måste kontrollera både bakteriemängden och endotoxinhalten, det räcker inte med bara en av dem. Dessa
värden är nämligen inte alltid korrelerade, eftersom endotoxinernas aktivitet kan variera beroende på bakterieart. Även när det inte finns några levande bakterier kan
det fortfarande finnas endotoxiner. Vid LAL-test är det
därför viktigt att notera att ett positivt svar indikerar att
endotoxin finns i provet, medan ett negativt svar inte garanterar att provet är pyrogenfritt. Pyrogener som inte är
endotoxiner kan fortfarande finnas i provet, utan att det
syns i ett LAL-test. Kontroll och identifiering av mikroorganismer är därför viktiga moment i processvalideringen
och den löpande kontrollen av omgivningshygienen.
Från kaniner till cellinjer
Innan LAL-testet uppfanns, kunde man bara testa för
pyrogener med hjälp av kaniner. Provlösningen injicerades i kaninerna, varpå man övervakade dem noga för att
se om de fick feber. Man fick alltså enbart ett kvalitativt
Foto: Robert Byron
resultat, och det fanns en hel del brister hos metoden.
Bland annat minskade försöksdjurens reaktion på pyrogen med tiden, det fanns en variabilitet i resultaten,
testet reagerade dåligt på Legionellatoxin, testet gick inte
att använda vid vissa läkemedel som radiofarmaceutika,
kemoterapiläkemedel, narkotika, steroider med mera.
Med LAL-testet kan man genomföra flera tester,
medan testet med kaniner är otympligt. Det kallas för
pyrogentest eftersom kaninerna reagerar på alla typer
av pyrogener och inte bara endotoxiner. Det är också
därför det fortfarande kan komma att användas vid
vissa tillfällen.
Idag går utvecklingen mot att försöka minska beroendet av dolksvansarna. En alternativ metod är användningen av genmodifierad rekombinant faktor C, där det
ämne i LAL som startar klottingreaktionen länkas med ett
fluorogeniskt substrat. En annan metod är att använda
cellinjer som är känsliga för LPS, också det länkat till ett
färgämne som ger färgförändringar i testlösningen. Inga
av dessa metoder är ännu accepterade i farmakopéerna.
DOLKSVANSENS BLOD skiljer sig från vårt på många sätt.
Bland annat så blir blodet blått i kontakt med syre, exempelvis
när djuret skadas eller tappas på blod.
Fakta om dolksvansen - en livs levande fossil
Dolksvansarna är fascinerande djur på många sätt. På
engelska kallas de Horseshoe crab på grund av sin form
och sitt skal. De är dock inte krabbor; de tillhör visserligen leddjuren men är närmare släkt med spindlar och
skorpioner. De är de närmast levande släktingarna till
de uråldriga trilobiterna, och till stora delar har de varit
oförändrade över 200 miljoner år, och därför kallas de för
ett levande fossil. Förutom den amerikanska arten finns
tre arter till i Asien. L. polyphemus kan bli upp till 60 centimeter medräknat svansen, de andra arterna är mindre.
Svansen är inget vapen utan används för att styra när
den simmar och som hjälp att komma på rätt köl om den
hamnat på rygg. Vilket inte alltid lyckas. Cirka tio procent
av dem som kommit i land dör på grund av att de inte
kan vända sig efter att en våg vänt dem på rygg. Djuren
uppskattas nå en ålder på arton till tjugotvå år
Dolksvansarna är havslevande djur som föredrar
mjuka, sandiga eller leriga bottnar på kontinentalhyllan.
Där lever de av maskar och mollusker, men också skaldjur
och småfisk. De kan ses på sandiga stränder dit de tar sig
för att para sig och lägga ägg. Så länge gälarna hålls fuktiga kan de klara en kortare tid på land. På den nordamerikanska östkusten tar de sig i land på våren, speciellt vid
vårfloden. Många av äggen äts av flyttfåglar som stannar
till här, den energirika födan är viktig för att de ska orka
hela vägen från de sydamerikanska övervintringslokalerna
till sommarens häckningslokaler i Arktis.
Omfattande forskning av olika slag har utförts med
dolksvansarna som modell. Det är bland annat strukturen, fysiologin och funktionen hos deras två stora
facettögon som studerats, och bland annat bidragit till
Nobelpriset i medicin 1967. Ögonens ovanligt stora nervceller underlättar forskning. Fascinerande nog förändras
dolksvansens synförmåga enligt en dygnsrytm. Nattetid
förändras formen på delögonen, vilket förstärker nattljuset en miljon gånger.
Dolksvansarna fångas och används som bete vid
fiske. Tidigare fångades de och användes som gödningsmedel eller föda till boskap. Antalet L. polyphemus har
minskat, men den anses inte direkt hotad. Minskningen
beror på fångsten till bete och på förstörelse av stränderna där fortplantningen sker. Olika typer av restriktioner har införts i olika delstater i USA för att skydda arten.
I Asien är läget sämre för dolksvansarna, framför allt på
grund av att den naturliga hemvisten förstörs, men säkra
uppgifter i ämnet saknas.
MEDTECH INFO 2-2011
7