Transcript mikrobiologiske undersøkelsesmetoder

Kvalitetssystem Klinikknivå - Nivå 2
Dok.nr: 2.3.4.8.6.1
Mikrobiologiske analysemetoder
Gjelder for: Klinikk Medisinsk Diagnostikk\Mikrobiologisk avdeling
Hovedområde:
Laboratoriehåndbok
Dokumenttype:
Laboratoriehåndbok
Utarbeidet / revidert av:
Toril Holmøy Svendsen
Godkjent av:
Bodil Ruud /
Revisjonsnr:
2.02
Godkj.
dato:
07.08.2014
Innledning
Ved mikrobiologisk laboratoriediagnostikk benyttes en rekke ulike
analysemetoder. Hvilken metode som er best egnet avhenger bl.a av hvilket agens
som skal påvises og hvor i sykdomsforløpet pasienten befinner seg. Basal
kunnskap om de forskjellige metodene er en viktig forutsetning for presis og
pålitelig diagnostikk.
I dette dokumentet gis en kortfattet, generell beskrivelse av analysemetodene
som benyttes ved Mikrobiologisk avdeling. For spesielt interesserte anbefales
lærebøker i medisinsk mikrobiologi (se referanselisten).
For spesifikk informasjon om de enkelte analyser, se Analyselisten.
Metoder
Hovedkategorier
Undersøkelsene som utføres ved vårt laboratorium kan inndeles i to
hovedkategorier:

Agensrettede undersøkelser, som omfatter etiologisk diagnostikk og
vurdering av immunstatus ved infeksjonssykdommer, med direkte eller
indirekte metoder

Diagnostikk ved immunologiske og revmatologiske sykdommer, med
påvisning av autoantistoffer (som ikke er rettet mot mikrober, men mot
kroppens egne celler eller strukturer) eller bestemmelse av vevstype. Dette
er ikke mikrobiologisk diagnostikk og omtales derfor ikke nærmere
Figuren nedenfor viser hvilke analysemetoder som benyttes ved agensrettede
undersøkelser ved vårt laboratorium, og hva som påvises med de ulike metodene.
Etiologisk diagnostikk
ved infeksjonssykdommer
Direkte
metoder
Dyrkning
Levende
bakterier
og sopp
Mikroskopi
Intakte
bakterier
og sopp
Hele eller
deler av
parasitter
Nukleinsyrepåvisning
RNA/DNA
fra virus og
bakterier
Indirekte
metoder
Antigenpåvisning
Antigener
fra virus og
bakterier
Toksinpåvisning
Bakterietoksiner
Antistoffpåvisning
Antistoffer
mot virus
og bakterier
Direkte og indirekte metoder
Side 1 av 4
Mikrobiologiske analysemetoder
Dokumentnr: 2.3.4.8.6.1
Revisjonsnr: 2.02
Agensrettede undersøkelser kan utføres med direkte eller indirekte metoder.
Direkte analysemetoder innebærer påvisning av selve det infeksiøse agens, eller
komponenter fra dette. Som direkte metoder regnes følgende:
-
Påvisning av selve mikroben ved hjelp av dyrkning og/eller mikroskopi.
-
Påvisning av antigener eller toksiner fra mikroben med tester for
antigenpåvisning eller toksinpåvisning.
-
Påvisning av mikrobens RNA eller DNA ved hjelp av molekylærbiologiske
metoder for nukleinsyrepåvisning.
Ved bruk av indirekte metoder påvises kroppens immunsvar mot det infeksiøse
agens. Ved vårt laboratorium innebærer dette påvisning av antistoffer av klasse
IgA, IgG og/eller IgM. Serologi eller infeksjonsimmunologi brukes ofte som felles
betegnelser for disse undersøkelsene.
Andre indirekte metoder er basert på påvisning av interferoner. Slike tester er ikke
tilgjengelig som rutinediagnostikk hos oss, men vi samarbeider med Rikshospitalet
om mottak av prøver til interferonbasert analyse (IGRA) ved utredning av latent
tuberkulose.
På rekvisisjonen er undersøkelsene som innebærer direkte påvisning av agens
plassert under overskriftene Dyrkning/mikroskopi/hurtigtester og
Nukleinsyrepåvisning (PCR).
Undersøkelsene som utføres ved hjelp av indirekte metoder, med påvisning av
antistoffer mot infeksiøse agens, finnes under overskriften Serologi/virologi.
Generelle og spesifikke metoder
Mikrobiologiske analysemetoder kan også deles inn i generelle og spesifikke
metoder. Med spesifikke metoder kan man ved den enkelte analyse kun påvise én
spesifikk mikrobe. Eksempler er antigen-, nukleinsyre- og antistoffpåvisning. Med
slike analyser undersøkes prøven med tanke på én spesifikk mikrobe, og resultatet
blir positivt eller negativt (eventuelt inkonklusivt/usikkert).
Ved bruk av generelle metoder gir derimot én og samme undersøkelse mulighet
for å påvise alle mikrober som metoden er egnet for. Dyrkning og mikroskopi er
eksempler på generelle metoder, og ved slike undersøkelser vil resultatet ofte
kunne være at flere mikrober er påvist. Med selektive medier og spesielle
fargeteknikker kan imidlertid også disse metodene gjøres spesifikke i varierende
grad.
For optimalt utbytte ved mikrobiologisk diagnostikk er det viktig at det letes etter
rett agens med rett metode i rett prøvemateriale på rett tidspunkt i
sykdomsforløpet. Før prøvetakingen kan det derfor være nyttig å tenke igjennom
følgende spørsmål:
-
Hvilke(n) mikrobe(r) skal det letes etter?
Hvilke(n) analysemetode(r) kan brukes til å påvise denne/disse?
Hvilken analysemetode er best egnet på det aktuelle tidspunktet i
sykdomsforløpet?
Hvilke typer prøvemateriale er egnet for den aktuelle undersøkelsesmetoden?
Dyrkning
Ved dyrkning påvises hele, levende mikrober, og metoden er velegnet for
påvisning av bakterier og sopp som lar seg dyrke på vanlige medier. Bakterier
som er svekket eller døde som følge av antibiotikabehandling kan være vanskelig
eller umulig å påvise med dyrkning. Supplerende undersøkelse med mikroskopi
og/eller nukleinsyrepåvisning kan da være til hjelp. Virusdyrkning og dyrkning av
parasitter utføres ikke ved vårt laboratorium.
Side 2 av 4
Mikrobiologiske analysemetoder
Dokumentnr: 2.3.4.8.6.1
Revisjonsnr: 2.02
Mange forskjellige prøvematerialer kan benyttes til dyrkning, avhengig av klinisk
problemstilling. Vanligste materialer er urin, puss og sårsekret, sekret fra luftveier
og genitalia, samt blodkultur og spinalvæske. Ved rekvirering av Generell
bakteriologisk undersøkelse vil laboratoriet undersøke prøvematerialet for alle
relevante bakterier. Ved rekvirering av spesifikke dyrkningsanalyser (f.eks MRSA,
Gonokokker og Gruppe B-streptokokker) vil prøven kun bli undersøkt med
henblikk på aktuell mikrobe.
Prøvene såes ut på faste og/eller eller flytende medier og inkuberes deretter i 1-5
dager (unntaksvis lengre) ved en temperatur og CO2-konsentrasjon tilpasset den
mikroben man ønsker å påvise. For påvisning av kravfulle mikrober er valg av
medium, inkuberingstid og temperatur/atmosfære avgjørende for resultatet. Gode
kliniske opplysninger hjelper laboratoriet til å analysere prøven på best egnet
måte og er derfor en forutsetning for god kvalitet på undersøkelsen.
Ved vekst av bakterier som vurderes som patogene eller mulig patogene, utføres
vanligvis resistensbestemmelse mot aktuelle antibiotika. Dyrkning er (med enkelte
unntak) den eneste metoden som gir mulighet for resistensbestemmelse av
bakterier.
For informasjon om resistensbestemmelse av bakterier, se Praksisnytt nr 1, 2011.
Mikroskopi
Prøvematerialet prepareres og farges og studeres i mikroskopet. Ved mikroskopi
påvises vanligvis hele mikroben. Undersøkelsen kan oftest ikke skille mellom døde
og levende organismer. Mikroskopi er i prinsippet en generell undersøkelse, men
kan ved hjelp av ulike fargeteknikker gjøres spesifikk.
Mikroskopi utføres ofte som supplement til dyrkning av bakterier og sopp. I tillegg
gjøres mikroskopi av feces ved mistanke om infeksjon med Tarmparasitter. Ved
mistanke om bestemte parasitter bør dette opplyses på rekvisisjonen, slik at
spesifikk undersøkelse med spesialfarging eventuelt kan utføres.
Antigenpåvisning
Antigener er mikrobestrukturer, mikrobeprodukter eller områder på mikrobens
overflate som kroppens immunforsvar kan danne antistoffer mot. Antigentester er
basert på spesifikk antistoff-antigenbinding. Testene kan benyttes på materialer
hvor mikroben eller nedbrytingsprodukter fra mikroben kan finnes.
Testene benyttes blant annet til påvisning av Adeno-/rotavirus i feces ved
gastroenteritt. Laboratoriet har også antigentester for påvisning av visse typer
bakterier, f.eks urinantigentester ved mistanke om Legionella pneumophila og
antigentester til spinalvæske for påvisning av de viktigste agens som gir bakteriell
meningitt. Antigentester inngår også i serologisk påvisning av Hepatitt B-virus
og HIV.
Toksinpåvisning
Toksiner er mikrobeprodukter med toksisk effekt, og kan påvises ved hjelp av
metoder som benytter spesifikke antistoffer mot toksinet, tilsvarende som ved
antigentester. Den eneste analysen ved vårt laboratorium som er basert på
toksinpåvisning er Clostridium difficile. Positivt resultat kan bestå i lang tid etter
at infeksjonen er overvunnet.
Nukleinsyrepåvisning
Nukleinsyrer er en fellesbetegnelse for arvestoff (RNA eller DNA).
Nukleinsyrepåvisning utføres med molekylærbiologiske metoder, vanligvis PCR
(polymerase chain reaction). Vi benytter både kommersielle og egenproduserte
analyser for nukleinsyrepåvisning. De fleste analysene har høy sensitivitet og
spesifisitet og har de senere år i stor grad tatt over for analyser basert på andre
metoder, spesielt antigen- og antistoffpåvisning.
Side 3 av 4
Mikrobiologiske analysemetoder
Dokumentnr: 2.3.4.8.6.1
Revisjonsnr: 2.02
Nukleinsyrepåvisning er velegnet til virusdiagnostikk, bl.a ved luftveisinfeksjoner,
gastroenteritt, encefalitt og som supplerende undersøkelse når det er påvist
antistoffer mot Hepatitt C-virus.
Nukleinsyrepåvisning brukes også for påvisning av bakterier som ikke kan dyrkes
på vanlige medier, f.eks Chlamydia trachomatis og atypiske bakterier
(Mycoplasma pneumoniae / Chlamydophila pneumoniae), og til påvisning
og/eller konfirmering av bestemte underkategorier av bakterier som MRSA og
EHEC.
Nukleinsyrepåvisning kan utføres i de fleste prøvematerialer. Valg av materiale
avhenger av klinisk problemstilling og hvor man kan forvente å finne den aktuelle
mikroben. Positivt resultat betyr at mikrobens nukleinsyre er til stede i
prøvematerialet, men skiller ikke mellom levende og døde mikrober. Analysen kan
derfor i noen tilfeller være positiv i flere uker etter at infeksjonen er sanert, f.eks
ved genital klamydiainfeksjon.
Serologi/infeksjonsimmunologi
Med serologi og infeksjonsimmunologi menes hovedsakelig antistoffpåvisning i
serum (eventuelt plasma), men begrepene omfatter hos oss også
antigenpåvisning (Hepatitt B-virus og HIV). I noen tilfeller utføres
antistoffpåvisning i andre prøvematerialer, eksempelvis antistoffer mot Borrelia
burgdorferi i spinalvæske.
Antistoffer er synonymt med immunglobuliner (Ig), og disse inndeles i klasser.
Ved serologisk infeksjonsdiagnostikk hos oss påvises spesifikke antistoffer av
klasse IgA, IgG og/eller IgM rettet mot bakterie- eller virusantigener. Et viktig
unntak fra dette er hurtigtesten for mononukleose, som påviser uspesifikke,
såkalte heterofile antistoffer, som er assosiert med infeksjon med Epstein-Barrvirus.
Antistoffresponsen ved ulike infeksjoner er svært forskjellig med hensyn til når
antistoffer av forskjellige klasser dannes, og hvor lenge antistoffene persisterer
etter gjennomgått infeksjon:
IgM dannes i akuttfasen av sykdom (og enkelte ganger etter vaksine) og
forsvinner vanligvis etter noen uker eller måneder, men kan dannes på ny ved
reaktivering av visse typer virus innen herpesvirusgruppen.
IgA dannes i slimhinner og er derfor blant annet assosiert med luftveisinfeksjoner.
Påvisning av IgA gjøres hos oss kun ved kikhosteserologi.
IgG dannes oftest senere enn IgM, og kan bestå i lang tid, noen ganger livet ut,
som tegn på gjennomgått infeksjon og i noen tilfeller immunitet. IgG kan også
påvises etter vaksine. Opplysninger om vaksinering er derfor viktig, spesielt ved
rekvirering av analyser mhp Hepatitt A-virus og Hepatitt B-virus.
Kunnskap om antistoffrespons ved ulike infeksjoner og kliniske opplysninger fra
rekvisisjonen danner grunnlaget for tolkningen av eventuelle funn av antistoffer i
serumprøve. Spesielt er opplysninger om tidspunktet for symptomdebut helt
nødvendig for at laboratoriet skal kunne foreta en god vurdering av
prøveresultatet. Er prøven tatt før antistoffdannelse kan forventes, vil resultatet
nødvendigvis bli negativt, selv om pasienten skulle være infisert med den aktuelle
mikroben.
Referanser
Rolf Schøyen: Mikroorganismer og sykdom. Lærebok i mikrobiologi og
infeksjonssykdommer for helsepersonell. Gyldendal Akademisk, 8. utg 2004
Miklos Degré m.fl: Medisinsk mikrobiologi. Gyldendal Akademisk, 2. utg 2000
Side 4 av 4