Transcript Lipidpåvirkning av koagulasjonsanalysene Antitrombin III og D

Det helsevitenskapelige fakultet, institutt for medisinsk biologi, bioingeniørutdanningen
Lipidpåvirkning av koagulasjonsanalysene
Antitrombin III og D-dimer
—
Av Nina Elde og Malin Nystad
Avsluttende bacheloroppgave, BIOIN-112, 30. mai 2014
Forord
Dette er vår avsluttende bacheloroppgave ved bioingeniørutdanningen ved Universitetet i Tromsø,
våren 2014. Vi har utført den praktiske delen av oppgaven ved fagområdet koagulasjon på
Laboratoriemedisin ved Universitetssykehuset Nord-Norge, Tromsø.
Vår oppgave gikk ut på å undersøke om koagulasjonsanalysene Antitrombin III (AT III) og Ddimer ble påvirket av lipider. Fagområdet koagulasjon har over lengre tid ønsket å kunne utvikle
faste rutiner og prosedyrer i forbindelse med lipemi-interferens ved disse analysene. På grunnlag av
deres ønsker har vi gjort et innledende studie for videre forskning.
Oppgaven er spesielt rettet mot bioingeniører ved fagområdet koagulasjon, men den kan også være
til interesse for øvrige bioingeniører på Laboratoriemedisin. I tillegg tror vi dette kan være til nytte
for avdelinger som utfører lipidinfusjon på pasienter.
Vi ønsker å rette en takk til Maria Averina som ga oss oppgaven og viste stort engasjement i
forbindelse med planlegging og oppstart av studiet. Vi ønsker også å takke vår faglige veileder
Sigrid Johannessen som har gjort et innledende pilotforsøk og stilt opp under hele prosessen, både
med den praktiske delen og bearbeidelse av resultater. Vi vil takke vår skriveveileder Jill-Tove
Indrevik for god, nøye og strukturert veiledning gjennom hele skriveprosessen. Det har vært til stor
nytte og hjelp for oss. Til slutt vil vi rette en takk til øvrige som har bidratt med svar på spørsmål og
stilt opp for oss.
Tromsø 30. mai 2014
Sammendrag
Bakgrunn: Lipoproteiner absorberer lys og vil interferere på fotometriske metoder. I tillegg kan
lipoproteiner fortrenge antigen slik at disse ikke lenger kan bindes til antistoff i
immunturbidimetriske metoder. Nytteverdien av å undersøke om fotometrisk avlesning blir påvirket
av lipider er derfor stor, da lipider kan føre til falske for lave resultater. AT III og D-dimer er to
viktige parametere i koagulasjonssystemet og begge analysene baseres på fotometrisk avlesning.
Hensikten med studiet er å undersøke om koagulasjonsanalysene AT III og D-dimer påvirkes av
lipider.
Materiale og metode: Seks pasientprøver for AT III ble benyttet, tre i patologisk område og tre i
normalområdet. For D-dimer ble det benyttet tre pasientprøver i det patologiske området.
Prøvematerialet som ble benyttet var natriumcitratplasma. For å kunne oppdage påvirkning av
lipider lagde vi to fortynningsrekker, den ene rekken fortynnet med intralipid og den andre rekken
fortynnet med buffer. Prøvene fortynnet med buffer fungerte som nullprøve.
Resultater og konklusjon: Resultater for AT III viser på alle seks prøvene, både i patologisk område
og i normalområdet, samme tendens ved at plasma tilsatt lipider gir lavere resultat enn nullprøven
med plasma tilsatt buffer. Resultatene for D-dimer viser en tendens til å gi lavere resultat for plasma
tilsatt lipider enn for nullprøven med plasma tilsatt buffer. For AT III kunne vi antyde en grense på
når lipider interferer den kolorimetriske metoden. Grensen ble antydet å være omtrent 5-6 g/l. For
D-dimer viser det seg at den immunturbidimetriske metoden påvirkes i mye større grad, og vi kunne
ikke antyde en grense på når lipider interfererer med metoden.
INNHOLD
1 Innledning ....................................................................................................................................................................................... 1
2 Teori.................................................................................................................................................................................................. 2
2.1 Koagulasjonssystemet ........................................................................................................................................................ 2
2.2 Forhold som påvirker prøvesvaret .................................................................................................................................. 5
2.2.1 Lipemi ............................................................................................................................................................................. 5
2.2.2 Lipemi-indeks ............................................................................................................................................................... 6
3 Materiale og metode .................................................................................................................................................................... 7
3.1 Pilotforsøk utført av Sigrid Johannessen ...................................................................................................................... 7
3.2 Prøveinnsamling og analysering ..................................................................................................................................... 7
3.3 Instrument ............................................................................................................................................................................... 7
3.3.1 Reagenser og kontroller ............................................................................................................................................. 8
3.3.2 Prinsipp ........................................................................................................................................................................ 10
3.4 Fortynninger ....................................................................................................................................................................... 12
4 Resultater...................................................................................................................................................................................... 13
4.1 Lipemi-indeks .................................................................................................................................................................... 13
4.2 AT III .................................................................................................................................................................................... 14
4.3 D-dimer ................................................................................................................................................................................ 18
5 Diskusjon ..................................................................................................................................................................................... 20
6 Konklusjon.............................................................................................................................................................................. 23
Referanseliste ......................................................................................................................................................................................
Vedlegg 1: Resultater AT III, patologisk område
Vedlegg 2: Resultater AT III, normalområde
Vedlegg 3: Resultater D-dimer, patologisk område
1 Innledning
Fagområdet koagulasjon ved Laboratoriemedisin ved Universitetssykehuset Nord-Norge (UNN),
analyserer koagulasjonsanalyser i den daglige rutinen. Fagområdet koagulasjon ønsker å utvikle
bedre rutiner på analysene AT III og D-dimer i forhold til lipemi-interferens. Grunnlaget for valg av
analyser baseres på at begge metodene avleses fotometrisk, der lipider kan påvirke metoden.
Tidligere er det ikke gjennomført tilsvarende studier for disse koagulasjonsanalysene, og
fagområdet ser derfor på dette som viktig og nyttig å undersøke. Infusjon av intralipid til pasienter
er vanlig på flere avdelinger, deriblant intensivavdeling. Tidligere ble infusjonen stoppet i 4 timer
før prøvetaking, mens den i dag stoppes i minimum 15 minutter før prøvetaking(16). På grunn av
nye rutiner og prosedyrer på infusjon av intralipid er det hensiktsmessig å undersøke om analysene
AT III og D-dimer blir påvirket av lipider.
Studiet er basert på et pilotforsøk utført av overbioingeniør Sigrid Johannessen ved koagulasjon,
Laboratoriemedisin UNN. Pilotforsøket tok utgangspunkt i hvordan lipider påvirker prøvesvar på
koagulasjonsanalysen D-dimer. I pilotforsøket ble det undersøkt ulike fortynninger med intralipid
og buffer. I vår studie har vi i tillegg til D-dimer undersøkt lipemi-interferens på AT III.(1)
For å kunne fastsette en entydig konklusjon trengs det flere prøver og paralleller. Denne studien er
en innledning for videre forskning, da det hadde vært for omfattende for oss å fullføre det.
Problemstilling: Kan koagulasjonsanalysene AT III og D-dimer påvirkes av lipider, og kan det
anbefales grenser for lipemi-interferens ved disse analysene?
1
2 Teori
2.1 Koagulasjonssystemet
Hemostase involverer samspillet mellom blodplater, koagulasjonsfaktorer og karveggen for å kunne
stoppe blødninger etter skade i blodkar. Den primære hemostasen tar for seg aktivering av
blodplater og adhering til skadested i form av primær blodplateplugg. Den sekundære hemostasen
aktiverer en rekke plasmaproteiner i koagulasjonssystemet. Dette fører til dannelsen av fibrin som
stabiliserer den primære platepluggen.(2)(3) Koagulasjon involverer biologiske forsterkningssystem
som ved relativt få substanser aktiverer koagulasjonskaskaden(4).
Når det oppstår en skade i blodkaret aktiveres det en kjedereaksjon. Normalt sirkulerer det i blodet
faktorer som aktiverer og hemmer koagulasjonen. Koagulasjonssystemet er delt inn i et indre og
ytre system. Det indre koagulasjonssystemet består av koagulasjonsfaktorer som finnes i plasma.
Det ytre koagulasjonssystemet har i tillegg til koagulasjonsfaktorer en aktivator, vevstromboplastin
(tissue factor, TF). TF er normalt fullstendig skilt fra sirkulerende blod.(2)
Tissue factor finnes på subendoteliale cellemembraner som fibroblaster og glatte muskelceller. TF
eksponeres ved karskade og binder faktor VII. Dette aktiverer koagulasjonskaskaden.
Kaskadereaksjonen fører til at de ulike faktorene i det indre og ytre systemet aktiverer hverandre.
Koagulasjonssystemet har også antikoagulante faktorer. Disse er viktige for å forhindre at tromber
dannes under normale forhold i blodet. Endotelceller produserer antikoagulante faktorer, heparin
kofaktor II, tissue factor pathway inhibitor (TFPI), trombomodulin og AT III. Andre hemmere er
bla. protein C og S-systemet.(5)
Antitrombin III er den viktigste antikoagulante faktoren. AT III er en plasma serinproteasehemmer
og produseres i leveren. AT III kontrollerer koagulasjonen ved å inaktivere trombin og aktiverte
former av faktor IX, X, XI og XII, ved å danne et kompleks mellom det aktive setet på
koagulasjonsfaktorene og AT III. Kompleksdannelsen går sakte uten tilstedeværelse av heparin.
Hastigheten av kompleksdannelsen øker betraktelig ved nærvær av heparin. De viktigste faktorene
AT III hemmer er trombin og faktor Xa.(3)(5)(6) Referanseområdet for AT III er 80 % til 120
%(21). Mangel på AT III har høyest klinisk betydning. Mangel på AT III kan ses i en rekke
tilstander som leversykdom, lungeemboli, nefrotisk syndrom, ved patologisk proteolyse som
disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC) og økt forbruk ved behandling av ufraksjonert
heparin(6). AT III-aktiviteten minker med alderen. Antikoagulante faktorer aktiverer i tillegg
2
fibrinolysen ved at tissue plasminogen activator (tPA), plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1),
urokinase og annexin-2 produseres(5).
Figur 1: Skisse over koagulasjonssystemet. Venstre del av figuren tar for seg fibrinolysen, mens
høyre del av figuren tar for seg koagulasjonen. Rosa og rød farge representerer koagulasjonen og
dannelsen av fibrin. Lyseblå og blå farge representerer fibrinolysen og nedbrytning av fibrin til D3
dimer. Gul farge representerer hemmere. TF og faktor VII bindes sammen og aktiverer
koagulasjonskaskaden. Figuren viser hvilke faktorer som aktiverer hverandre, samt hvor
hemmerene utøver sin funksjon. Uthevet farge illustrerer det området studien baserer seg på.
Heparin/low molecular weight heparine (LMWH) aktiverer AT III som i hovedsak hemmer faktor X
og Trombin. Dette fører til at trombin ikke vil kunne fungere optimalt. Plasminogen som finnes i
blodkoagelet aktiverer enzymet plasmin. Plasmin bryter ned fibrin slik at vi får sluttproduktet Ddimer. Forkortelser: alfa 2 antiplasmin ( 2AP), dermatan sulfate (DS), heparin cofactor II (HC II),
hight molecular weight kininogen (HMWK), plasminogen activators (PA), platelet factor 3 (PF3),
prekallikrein (PK), tissue factor pathway inhibitor (TFPI). Figuren er basert på en oversikt fra
Diagnostica Stago(7).
Fibrinolysen er viktig for opprettholdelsen av blodstrømmen, og at tromben blir lokalisert slik at
den blir oppløst når skaden er tilhelet. Fibrinolysen er regulert av en rekke fibrinolytiske
enzymer.(8) Under dannelsen av en trombe vil små mengder av plasminogen bli bundet til fibrin.
tPA er frigitt fra endotelceller. tPA har høy affinitet til fibrin og vil dermed absorberes til tromben.
Plasminogen i tromben blir aktivert til plasmin ved at delvis nedbrutt fibrin bindes til plasminogen.
Plasmin bryter systematisk ned kryssbundet fibrin til fragmentkomplekser, D-dimer, fragment E og
fragment D. D-dimer er et endeprodukt av uløselig fibrin i tromben og består av to D-domener fra
separate fibrinmolekyler som har blitt kryssbundet av faktor XIIIa i fibrinprosessen (figur 2).(3) Ddimer finnes ikke i fibrinogen eller løselig fibrin og er dermed spesifikk for nedbrytningen av
uløselig fibrin(6). D-dimer avspeiler den fibrinolytiske aktiviteten etter aktivering av
koagulasjonen(9). D-dimer immunoassay brukes for å identifisere kronisk og akutt DIC, og for
utredning av venetrombose eller lungeemboli(3). Nivået av D-dimer øker raskt (innen 6 timer) når
fibrinolysen settes i gang for eksempel ved lungeemboli eller dyp venetrombose. Til vanlig er Ddimernivået svært lavt.(10) Referanseområdet for D-dimer er <0,50 μg/ml(11).
4
Figur 2: Skisse av nedbrytningen av fibrin. 1. Fibrinogen. 2. Trombin omdanner fibrinogen til
fibrinmonomerer med bindingssteder. 3. Fibrinmonomerer bindes sammen til fibrinpolymerer. I
fibrinpolymerer dannes faktor XIII-induserte peptidbindinger mellom to D-fragmenter(3). 4.
Fibrinolysen bryter ned fibrinpolymerer til fragment D, fragment D-dimer og fragment E. Figuren
er basert på bilde fra UiO(12).
2.2 Forhold som påvirker prøvesvaret
2.2.1 Lipemi
Lipemi er opphopning av lipoproteiner slik at prøvens turbiditet øker, og den ser blakket ut. De
vanligste typene lipoproteiner er kylomikroner, very low density lipoprotein, low density
lipoprotein og high density lipoprotein.(13) Hovedårsaken til den økte turbiditeten skyldes de
største lipoproteinene, kylomikroner. Kylomikroner har en partikkelstørrelse på 70-1000 nm, og
inneholder i hovedsak triglyserider.(14) Etter et fettholdig måltid sirkulerer kylomikroner i plasma.
Noen pasienter trenger lipidinfusjon for å få næring og tilførsel av essensielle fettsyrer og
fosfat.(15) For å unngå at analysesvar blir påvirket av lipider er det viktig å sikre at
blodprøvetakingen er utført korrekt ved infusjon av intralipider. Tidligere ble infusjon av intralipid
stoppet i 4 timer før prøvetaking. Med ny prosedyre må infusjonen av intralipid være stoppet i
minimum 15 minutter før prøvetaking(16).
5
Lipoproteiner absorberer lys, og kan derfor interferere på fotometriske metoder. Mengden av det
absorberte lyset er omvendt proporsjonalt til bølgelengden og avtar fra 300 til 700 nm. Lipemi
påvirker derfor metoder som benytter lavere bølgelengder.(14)
Lipemi påvirker immunologiske metoder hvor turbiditeten i en løsning avleses fotometrisk. Lipider
påvirker metoden ved at de fortrenger antigen-antistoffkompleksdannelsen. Lipider er store
molekyler og absorberer derfor lyset ved avlesning. Det fører til at mindre lys slippes gjennom
løsningen slik at mindre turbiditet måles. Dette gir falske for lave resultater.(17)
2.2.2 Lipemi-indeks
Lipemi kan vurderes visuelt, men kun dersom konsentrasjonen av triglyserider er over 3,4 mmol/l.
Instrumentell måling av lipemi-indeks er derfor et bedre mål på hvor lipemisk prøven er. Det er kun
lipemiske prøver som absorberer lys rundt 700 nm, og bølgelengder i dette området er derfor brukt
for å måle graden av lipemi. Lipemi-indeks kan måles på instrumenter for medisinsk biokjemi.
Cobas (Roche Diagnostics Norge AS, Oslo) bruker bølgelengdene 660/700 nm til måling av lipemiindeks. Absorbansen er proporsjonal med mengden lipider i prøven.(14) Lipemi-indeks gir en verdi
basert på turbiditeten i prøven avhengig av partikkelstørrelsen og dermed ikke konsentrasjonen av
triglyserider. Verdien på lipemi-indeksen er semikvantitativ, noe som betyr at en lipemi-indeks på
omtrent 500 tilsvarer en konsentrasjon av intralipid i prøven på omtrent 500 mg/dl(17)(18).
6
3 Materiale og metode
3.1 Pilotforsøk utført av Sigrid Johannessen
I pilotforsøket ble lipemi-indeksen målt på D-dimer ved ulike fortynninger. Intralipid fortynnet med
buffer i forholdet 1:16 ble brukt til å fortynne plasma. Fortynningene som ble benyttet var 1 del
lipidløsning + 10 deler plasma (prøve 1), 1 del lipidløsning + 6 deler plasma (prøve 2), og 1 del
lipidløsning + 4 deler plasma (prøve 3). For å kunne undersøke forskjeller på lipemiske prøver og
ikke-lipemiske prøver ble de samme fortynningene brukt i nye prøver der lipidløsningen ble byttet
ut med buffer. Med disse fortynningene ble det målt lipemi-indeks på plasma fortynnet med lipider.
Lipemi-indeks på prøve 1 ble målt til 74, prøve 2 til 114 og prøve 3 til 275.(1)
Ettersom det var ønskelig med en lipemi-indeks på rundt 1000 ble det konkludert med at
utgangsfortynningen skulle inneholde større mengder intralipider, i forholdet 1:11.(1)
3.2 Prøveinnsamling og analysering
Pasientprøver benyttet i denne studien ble anonymisert. Prøvetakningen ble utført av autoriserte
bioingeniører i daglig rutine. Prøvetakingen skal gjennomføres etter standard og prosedyre, og vi
gikk derfor ut fra at disse ble tatt på korrekt måte. Koagulasjonsanalysene ble tatt på
natriumcitratglass (kat.nr. 367714, BD Vacutainer, Puls-Norge, Oslo), og var helt fulle for å få et
korrekt forhold mellom væsketilsetningen og blodet (1:10)(9). Dette var viktig fordi citrat er en
antikoagulant, der citrat binder kalsium i blodet som fører til en hindret koagulasjon(19). Vi plukket
ut 4-6 sentrifugerte prøver for hver analyse, og analyserte D-dimer og AT III på disse. For D-dimer
brukte vi prøver i området 2-9 µg/ml. For AT III brukte vi prøver rundt 50-70 % i det patologiske
området og rundt 90-110 % i normalområdet.
3.3 Instrument
Analyseringen av koagulasjonsanalysene AT III og D-dimer ble utført på instrumentet STA-R
Evolution (Diagnostica Stago – 9,rue des Freres Chausson, 92600 Asnieres, France). Instrumentet
er kalibrert på forhånd av autoriserte bioingeniører ved fagområdet koagulasjon. Instrumentet er
helautomatisert noe som betyr at all prøvebehandling, reagenstilsetning, analysering og utgivelse av
svar skjer automatisk i rutinen. Instrumentet er designet og verifisert for analysering av humant
7
plasma. Analyseringen gjøres til vanlig i forbindelse med undersøkelser og diagnostisering av
pasientens koagulasjon og ved behandling med antikoagulant.(20)
3.3.1 Reagenser og kontroller
Reagenser
Testkittet STA – STACHROM® AT III (kat.nr. 00596, Diagnostica Stago, France) ble benyttet til
analysering av AT III i denne studien. Reagens 1 består av frysetørret bovint trombin. Reagens 2
består av frysetørret kromogent substrat (CBS 61.50, ca. 1,4 μmol EtM-SPro-Arg-pNA, AcOH per
ml oppløst reagens.) Reagens 3 består av buffer som inneholder heparin.(21)
Reagensene ble oppbevart ved 2-8oC og fikk romtemperatur før bruk, ca. 30 min på benk. Vi helte
reagens 3 oppi reagens 1 fra samme kit. Til reagens 2 tilsatte vi 3 ml destillert vann. Reagensene
stod 60 minutter på benk før de ble blandet godt. Deretter satte vi en STA®-mini Reducer (REF
00797, Diagnostica Stago, France) ned i flasken og den perforerte korken ble satt på igjen.(21)
Testkittet STA – LIATEST® D-DI (kat.nr. 00515, Diagnostica Stago, France) ble benyttet til
analysering av D-dimer i denne studien. Reagens 1 består av Tris-buffer. Reagens 2 består av en
suspensjon av latexmikropartikler, belagt med to typer antihumane D-dimermonoklonale antistoffer
fra mus som er stabilisert med bovint serumalbumin.(9)
Reagensene ble oppbevart ved 2-8oC og fikk romtemperatur før bruk, ca. 15 min på benk. Reagens
1 og 2 var klare til bruk. De ble blandet forsiktig for å unngå bobledannelse. Vi satte en STA®-mini
Reducer (kat.nr. 00797, Diagnostica Stago, France) ned i flasken og den perforerte korken på.(9)
8
Kontroller
Det ble benyttet kvalitetskontroller for koagulasjonsanalysene AT III og D-dimer.
Kvalitetskontrollene var nødvendige for å kunne verifisere resultatenes nøyaktighet og
reproduserbarhet.(9)
Det ble analysert kvalitetskontroller ved oppstart av instrumentet og ved utskiftning av reagens.
Kvalitetskontrollene ble analysert ved to nivåer, i normalområdet og i patologisk område. Før
analyseringen av prøvene ble kvalitetskontrollene godkjent innenfor gitte grenser.
Kontrollkittet STA – SYSTEM CONTROL [N] + [P] (kat.nr. 00678, Diagnostica Stago, France)
ble benyttet til analysering av kvalitetskontroll for AT III. Kontrollreagens 1 er STA® - System
Control [N], som er et citratbehandlet frysetørret normalt humant plasma. Kontrollreagens 2 er
STA® - System Control [P], som er et citratbehandlet frysetørret anormalt humant plasma.(23)
Kontrollkittet STA-LIATEST® CONTROL [N] + [P] (kat.nr. 00526, Diagnostica Stago, France) ble
benyttet til kvalitetskontroll av antigenanalysen ved immunturbidimetrisk metode for D-dimer.
Kontrolleagens 1 STA® - Liatest® Control [N], inneholder frysetørret normalt humant citratplasma.
Kontrollreagens 2 STA® - Liatest® Control [P], inneholder frysetørret anormalt humant
citratplasma.(24)
Kontrollreagensene ble oppbevart ved 2-8oC før bruk. Til hvert kontrollreagens ble det tilsatt 1 ml
destillert vann. Oppløsningene ble stabilisert i 30 minutter ved romtemperatur (18-25oC), før de ble
blandet godt slik at oppløsningene ble homogeniserte. Kontrollreagensene hadde en holdbarhet på 8
timer i instrumentet.(23)(24)
9
3.3.2 Prinsipp
Antitrombin III
Figur 3: Skisse av måleprinsippet for AT III. 1. Trombin og heparin inkuberes sammen med kjent
mengde trombin i overskudd. 2. AT III hemmer trombin i nærvær av heparin, og substrat binder
fritt trombin. 3. pNA spaltes av substratet og gir en fargeutvikling som måles fotometrisk.
Analysen er en kvantitativ bestemmelse av antitrombinaktiviteten. Ved analysering av AT III
brukes det kromogene substrater, altså er det en enzymatisk metode. AT III har en kraftig og
umiddelbar hemmende virkning på trombin ved tilstedeværelse av heparin. Metoden består av to
trinn; plasma inkuberes med heparin og en kjent mengde trombin i overskudd. Måling av resterende
trombin skjer ved hjelp av bestemt amidolytisk aktivitet på det kromogene substratet CBS 61.50.
Målingene baseres på absorbans av monokromatisk lys som passerer gjennom kyvetten mens de
respektive kromogene reaksjonene pågår. Frisatt pNA (paranitroanilin) måles ved 405 nm. Målt
frisatt pNA er omvendt proporsjonal med mengden antitrombin i plasma.(21)(25)
10
D-dimer
Figur 4: Skisse av måleprinsippet for D-dimer. Monoklonale antistoff spesifikk for D-dimer bundet
til latexmikropartikler, bindes til D-dimer og danner antigen-antistoffkompleks. Antigenantistoffkomplekset danner agglutinat som fører til turbiditet i prøven. Den økte turbiditeten måles
fotometrisk.
Analysen er basert på fotometrisk måling av økt turbiditet i suspensjon av latexmikropartikler. Når
små latexmikropartikler er kovalent bundet til monoklonalt antistoff spesifikk for D-dimer i plasma,
dannes det et antigen-antistoffkompleks som agglutinerer. Dette fører til økt turbiditet i prøven som
sier noe om mengden D-dimer.(9) Instrumentet gjør to målinger ved samme bølgelengde. Ved
første måling detekteres både lys sendt gjennom kyvetten fra lyskilden i instrumentet, og lys fra
omgivelsene. Ved andre måling detekteres kun lyset fra omgivelsene. Lyset fra omgivelsene kan
deretter trekkes fra på grunnlag av første måling. Transmittert lys blir målt slik at vi får et mål på
det absorberte lyset ved A = - log (I1 / I0), A er absorbansen, I1 er lyset som sendes igjennom
kyvetten og lyset fra omgivelsene, I0 er lyset som sendes igjennom kyvetten. Målingen skjer ved
540 nm.(26) Metoden har begrensninger i svært ugjennomskinnelig/blakket plasma, der D-dimer
nivået kan måles for lavt. Referanseområde for D-dimer er <0,5 µg/ml(9)(25).
11
3.4 Fortynninger
Med pilotforsøket (3.1) som utgangspunkt justerte vi fortynningene for å undersøke om lipemiindeksen var optimal for analysene AT III og D-dimer med ny lipidløsning (1:11). Ut fra testingen
kom vi fram til nye fortynninger som kunne brukes i vår studie.
Lipidfortynning:
(1:11) 100 µl intralipid + 1000 µl Owren-kollerbuffer
Fortynninger:
I
6 deler intralipid + 1 del plasma
(360 µl + 60 µl)
II
4 deler intralipid + 1 del plasma
(320 µl + 80 µl)
III
3 deler intralipid + 2 deler plasma
(240 µl + 160 µl)
Som fettstoff brukte vi Intralipid 200 mg/ml (ATC-nr. B05B A02, Fresensius Kabi Norge AS, NO1753 Halden)(15). Som diluent brukte vi STA-OWREN-KOLLER (kat.nr. 00360, Diagnostica
Stago, France) bufferoppløsning(22).
Fortynning av prøver
Vi lagde to fortynningsrekker for hver prøve med fortynningene nevnt ovenfor. Den første rekken
var med intralipid + plasma og den andre rekken var med buffer + plasma. Prøven med buffer var
nullprøven. På den måten kunne vi sammenligne plasma tilsatt intralipid og plasma tilsatt buffer,
slik at vi kunne se om det ble forskjell på prøveresultatet. For å homogenisere prøven blandet vi den
godt rett godt rett før analysering ettersom intralipider vil legge seg over plasma. Vi undersøkte
lipemi-indeks på alle prøvene tilsatt intralipid, og på noen prøver tilsatt buffer. Alle lipemi-indeks
ble analysert ved Cobas 8000 (Roche Diagnostics, Norge) ved fagområdet medisinsk biokjemi ved
Laboratoriemedisin, UNN.
Antitrombin III har en tillatt analytisk variasjon (VKa) på <10 % for resultater <50 %(27). D-dimer
har en tillatt VKa på 5 % for resultater > 0,50 µg/ml(11). Vi ønsket å bruke en grense på +/- to
standardavvik for begge analysene. Grensen for AT III ble +/- 20 % tillatt avvik, mens for D-dimer
ble den +/- 10 % tillatt avvik. Prøver for AT III >50% har en VKa på <5 %, og prøver for D-dimer
<0,50 µg/ml har en VKa på 12 %(27)(11).
12
4 Resultater
4.1 Lipemi-indeks
Målt lipemi-indeks i prøver tilsatt intralipid
Tabell 1: Lipemi-indeks på prøver tilsatt intralipid.
Prøvenummer
Plasma tilsatt
Plasma tilsatt
Plasma tilsatt
intralipid, fortynning
intralipid, fortynning
intralipid, fortynning
I (1+6)
II (1+4)
III (2+3)
001
661
602
460
006
676
626
474
007
668
627
477
009
670
633
477
Median
669
626,5
475,5
Tabellen viser målt lipemi-indeks på fire prøver tilsatt intralipider. På grunn av lavt antall prøver og
ukjent statistisk fordeling, er median regnet ut på grunnlag av verdiene av de fire prøvene.
Målt lipemi-indeks i prøver tilsatt buffer
Tabell 2: Lipemi-indeks på prøver tilsatt buffer.
Prøvenummer
Plasma tilsatt buffer,
Plasma tilsatt buffer,
Plasma tilsatt buffer,
fortynning I (1+6)
fortynning II (1+4)
fortynning III (2+3)
007
2
2
6
009
2
9
16
Tabellen viser målt lipemi-indeks på to prøver tilsatt buffer.
13
4.2 AT III
Målt AT III i prøver i patologisk område
Tabell 3 - Prøver AT III, patologisk område.
Prøvenummer
Fortynning
I (1+6)
Plasma tilsatt
Plasma tilsatt
Beregnet
intralipid (%)
buffer (%)
forskjell (%)
mellom tilsatt
II (1+4)
lipid og tilsatt
III (2+3)
buffer
001
I
11
17
35
001
II
15
21
29
001
III
30
33
9
002
I
11
16
31
002
II
16
19
16
002
III
32
34
6
003
I
13
20
35
003
II
18
23
22
003
III
33
34
3
Resultater for prøvenummer 001
Ved fortynning I fikk prøven en AT III-verdi på 11 % når den var tilsatt 6 deler intralipid (fortynnet
1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 17 % når den var tilsatt 6
deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 35 %. Ved fortynning II fikk
prøven en AT III-verdi på 15 % når den var tilsatt 4 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 1 del
plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 21 % når den var tilsatt 4 deler buffer og 1
del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 29 %. Ved fortynning III fikk prøven en AT III14
verdi på 30 % når den var tilsatt 3 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med
tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 33 % når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den
beregnede forskjellen utgjorde 9 %.
Resultater for prøvenummer 002
Ved fortynning I fikk prøven en AT III-verdi på 11 % når den var tilsatt 6 deler intralipid (fortynnet
1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 16 % når den var tilsatt 6
deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 31 %. Ved fortynning II fikk
prøven en AT III-verdi på 16 % når den var tilsatt 4 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 1 del
plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 19 % når den var tilsatt 4 deler buffer og 1
del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 16 %. Ved fortynning III fikk prøven en AT IIIverdi på 32 % når den var tilsatt 3 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med
tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 34 % når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den
beregnede forskjellen utgjorde 6 %.
Resultater for prøvenummer 003
Ved fortynning I fikk prøven en AT III-verdi på 13 % når den var tilsatt 6 deler intralipid (fortynnet
1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 20 % når den var tilsatt 6
deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 35 %. Ved fortynning II fikk
prøven en AT III-verdi på 18 % når den var tilsatt 4 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 1 del
plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 23 % når den var tilsatt 4 deler buffer og 1
del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 22 %. Ved fortynning III fikk prøven en AT IIIverdi på 33 % når den var tilsatt 3 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med
tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 34 % når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den
beregnede forskjellen utgjorde 3 %.
15
Målt AT III i prøver i normalområdet
Tabell 4 - Prøver AT III, normalområdet.
Prøvenummer
Fortynning
I (1+6)
Plasma tilsatt
Plasma tilsatt
Beregnet
intralipid (%)
buffer (%)
forskjell (%)
mellom tilsatt
II (1+4)
lipid og tilsatt
III (2+3)
buffer
004
I
18
24
25
004
II
26
29
10
004
III
46
48
4
005
I
18
25
28
005
II
25
29
14
005
III
49
49
0
006
I
18
25
28
006
II
27
31
13
006
III
50
49
2
Resultater for prøvenummer 004
Ved fortynning I fikk prøven en AT III-verdi på 18 % når den var tilsatt 6 deler intralipid (fortynnet
1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 24 % når den var tilsatt 6
deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 25 %. Ved fortynning II fikk
prøven en AT III-verdi på 26 % når den var tilsatt 4 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 1 del
plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 29 % når den var tilsatt 4 deler buffer og 1
del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 10 %. Ved fortynning III fikk prøven en AT IIIverdi på 46 % når den var tilsatt 3 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med
16
tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 48 % når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den
beregnede forskjellen utgjorde 4 %.
Resultater for prøvenummer 005
Ved fortynning I fikk prøven en AT III-verdi på 18 % når den var tilsatt 6 deler intralipid (fortynnet
1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 25 % når den var tilsatt 6
deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 28 %. Ved fortynning II fikk
prøven en AT III-verdi på 25 % når den var tilsatt 4 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 1 del
plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 29 % når den var tilsatt 4 deler buffer og 1
del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 14 %. Ved fortynning III fikk prøven en AT IIIverdi på 49 % når den var tilsatt 3 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med
tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 49 % når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den
beregnede forskjellen utgjorde 0 %.
Resultater for prøvenummer 006
Ved fortynning I fikk prøven en AT III-verdi på 18 % når den var tilsatt 6 deler intralipid (fortynnet
1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 25 % når den var tilsatt 6
deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 28 %. Ved fortynning II fikk
prøven en AT III-verdi på 27 % når den var tilsatt 4 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 1 del
plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 31 % når den var tilsatt 4 deler buffer og 1
del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 13 %. Ved fortynning III fikk prøven en AT IIIverdi på 50 % når den var tilsatt 3 deler intralipid (fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med
tilsatt buffer fikk en AT III-verdi på 49 % når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den
beregnede forskjellen utgjorde 2 %.
17
4.3 D-dimer
Målt D-dimer i prøver i patologisk område
Tabell 5 - Prøver D-dimer, patologisk område.
Prøvenummer
Fortynning
I (1+6)
II (1+4)
Plasma tilsatt
Plasma tilsatt
Beregnet
intralipid
buffer
forskjell (%)
(µg/ml)
(µg/ml)
III (2+3)
mellom tilsatt
lipid og tilsatt
buffer
007
I
0,63
0,37
70
007
II
0,52
0,33
58
007
III
0,75
0,74
1
008
I
0,17
0,53
68
008
II
0,42
0,82
49
008
III
1,20
1,69
29
009
I
0,29
1,20
76
009
II
0,68
1,65
59
009
III
1,65
3,07
46
Resultater for prøvenummer 007
Ved fortynning I fikk prøven en D-dimerverdi på 0,63 µg/ml når den var tilsatt 6 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 0,37 µg/ml når
den var tilsatt 6 deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 70 %. Ved
fortynning II fikk prøven en D-dimerverdi på 0,52 µg/ml når den var tilsatt 4 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 0,33 µg/ml når
den var tilsatt 4 deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 58 %. Ved
18
fortynning III fikk prøven en D-dimerverdi på 0,75 µg/ml når den var tilsatt 3 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 0,74 µg/ml
når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 1 %.
Resultater for prøvenummer 008
Ved fortynning I fikk prøven en D-dimerverdi på 0,17 µg/ml når den var tilsatt 6 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 0,53 µg/ml når
den var tilsatt 6 deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 68 %. Ved
fortynning II fikk prøven en D-dimerverdi på 0,42 µg/ml når den var tilsatt 4 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 0,82 µg/ml når
den var tilsatt 4 deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 49 %. Ved
fortynning III fikk prøven en D-dimerverdi på 1,20 µg/ml når den var tilsatt 3 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 1,69 µg/ml
når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 29 %.
Resultater for prøvenummer 009
Ved fortynning I fikk prøven en D-dimerverdi på 0,29 µg/ml når den var tilsatt 6 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 1,20 µg/ml når
den var tilsatt 6 deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 76 %. Ved
fortynning II fikk prøven en D-dimerverdi på 0,68 µg/ml når den var tilsatt 4 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 1 del plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 1,65 µg/ml når
den var tilsatt 4 deler buffer og 1 del plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 59 %. Ved
fortynning III fikk prøven en D-dimerverdi på 1,65 µg/ml når den var tilsatt 3 deler intralipid
(fortynnet 1:11) og 2 deler plasma. Prøven med tilsatt buffer fikk en D-dimerverdi på 3,07 µg/ml
når den var tilsatt 3 deler buffer og 2 deler plasma. Den beregnede forskjellen utgjorde 46 %.
19
5 Diskusjon
Denne studien er en innledende undersøkelse om lipider påvirker koagulasjonsanalysene AT III og
D-dimer. For å kunne antyde en grenseverdi har vi målt lipemi-indeks på de fortynnede prøvene
som ble benyttet i dette studiet. Det er utviklet en ny prosedyre for blodprøvetaking i forbindelse
med infusjon av intralipid. Lipemi-indeksen skal måles dersom blodprøver er tatt etter en pågående
infusjon er stoppet i minimum 15 minutter, uavhengig av tidligere bestilte analyser(16). Dette er en
fordel dersom det kan fastsettes grenseverdier for lipemi-interferens for analysene AT III og Ddimer.
For å kunne antyde en grenseverdi for lipemi-interferens for analysene AT III og D-dimer er lipemiindeksen målt på fire lipemiske prøver (tabell 1), med ulike intralipidkonsentrasjoner. Prøvene med
størst mengde intralipid (fortynning I) har en lipemi-indeks på omtrent 670, dette tilsvarer en
konsentrasjon av intralipid på omtrent 7 g/l. Prøvene med fortynning II har en lipemi-indeks på
omtrent 620, som tilsvarer en konsentrasjon av intralipid på omtrent 6 g/l. Prøvene med fortynning
III har en lipemi-indeks på omtrent 470, som tilsvarer en konsentrasjon av intralipid på omtrent 5
g/l. Vi har ikke analysert prøver for AT III eller D-dimer ved lavere lipemi-indeks enn 470 i dette
studiet.
Det viser seg at prøver uten synlig lipemi ikke har en betydelig høy lipemi-indeks, og vi vurderer
det som unødvendig å måle den for alle prøvene tilsatt buffer (tabell 2). Den høyeste lipemiindeksen målt i plasma tilsatt buffer er målt til 16, denne var i utgangspunktet litt synlig lipemisk.
Det var derfor usannsynlig at andre ikke-lipemiske prøver i vår studie skulle ha høyere lipemiindeks.
AT III
Dersom lipider ikke hadde noen innvirkning på analysen ville vi antatt at prøvene med intralipid og
prøvene med buffer ikke ville gi forskjellig resultat.
Prøvene i patologisk område viser samme tendens ved de ulike fortynningene. Tendensen vi så var
at plasma med intralipid viste lavere verdier enn plasma med buffer. Lipemiske prøver med
fortynning I og II viste et resultat på rundt 20 % til 30 % lavere enn prøvene med buffer. Lipemiske
prøver med fortynning III viste et resultat på rundt 3 % til 9 % lavere enn prøvene med buffer. Fordi
vi har en tillatt variasjon på 20 % viser det seg at prøvene til fortynning I og II ikke ligger innenfor
den tillatte variasjonen. Prøvene til fortynning III ligger innenfor den tillatte variasjonen. Det tyder
20
på at lipider ikke interfererer med metoden opptil en lipemi-indeks på omtrent 470, altså en
konsentrasjon av intralipid på omtrent 5 g/l.
Prøvene i normalområdet viste samme tendens som prøvene i patologisk område. Lipemiske prøver
med fortynning I viste et resultat på rundt 20 % lavere enn prøvene tilsatt buffer. Lipemiske prøver
med fortynning II viste et resultat på rundt 10 % lavere enn prøvene med buffer. Lipemiske prøver
med fortynning III viste et resultat opptil 4 % lavere enn prøvene med buffer. I motsetning til
prøver i patologisk område, viser det seg at metoden tåler større konsentrasjon av intralipid i prøver
i normalområdet. Prøvene til fortynning II og III ligger innenfor den tillatte variasjonen. Det tyder
på at lipider ikke interfererer med metoden opptil en lipemi-indeks på omtrent 620, altså en
konsentrasjon av intralipid på omtrent 6 g/l.
Ut fra prøveresultatene i både patologisk område og normalområdet viser det seg at lipider kan
interferere med metoden for AT III. En forklaring på at måleresultatene for AT III blir lavere i
lipemiske prøver, kan være at lipoproteiner tilstede i prøven absorberer lys(14). Når lyset
absorberes vil mindre lys bli sendt gjennom kyvetten, mindre lys blir detektert og vi kan få falske
for lave resultater. Falske for lave resultater kan ha stor betydning for pasienten, da prøver som i
utgangspunktet er i normalområdet kan vise resultater i patologisk område. Dette kan føre til
usikker diagnostisering av pasientens tilstand. Grenseverdier for lipemi-interferens ved analysen for
AT III kan være nyttig for å unngå falske lave resultater.
D-dimer
For D-dimer har vi kun brukt prøver i det patologiske området. Prøver i normalområdet har så lav
utgangsverdi at disse ikke ville vært målbare etter fortynning. Måleområdet for D-dimer er fra 0,27
μg/ml til 4,0 μg/ml. D-dimer har et referanseområde på <0,50 μg/ml, og det skal derfor ikke mye til for at prøver i normalområdet blir fortynnet til utenfor måleområdet.(9) Fordi hovedvekten av
resultatene er over referanseområdet, valgte vi å beholde VKa på 5 % for alle resultatene, noe som
betyr en tillatt variasjon på 10 %.
Prøve 007 med intralipid viste med fortynning I et resultat på 70 % høyere enn prøve 007 med
buffer. Med fortynning II viste samme prøve med intralipid et resultat på 58 % høyere enn prøven
med buffer. Med fortynning III viste prøven med intralipid 1 % høyere resultat enn for prøven med
buffer. Ut fra resultatene i tabell 5 kan det skyldes en feil at prøve 007 med fortynning III ikke viser
noen beregnet forskjell mellom prøven med intralipid og prøven med buffer.
21
Prøve 008 og 009 med intralipid viste med fortynning I et resultat på 68 % og 76 % lavere enn
prøve 008 og 009 med buffer. Prøve 008 hadde en verdi på 0,17 μg/ml med fortynning I. Dette resultatet ligger utenfor nedre målegrense for D-dimer som er 0,27 μg/ml, og er derfor usikkert.
Prøve 008 og 009 med intralipid viste med fortynning II et resultat på 49 % og 59 % lavere enn
prøve 008 og 009 med buffer. Prøve 008 og 009 med intralipid viste med fortynning III et resultat
på 29 % og 46 % lavere enn prøve 008 og 009 med buffer. Prøve 008 og 009 viste ved alle
fortynningene forskjell over tillatt variasjon på 10 %. På grunnlag av metoden for D-dimer er det
ikke logisk at lipemiske prøver skal vise høyere resultat enn ikke-lipemiske prøver slik prøve 007
gjorde. Lipider ”fortrenger” D-dimerkomplekset slik at avlest mengde D-dimer blir lavere, og det er
derfor mer sannsynlig at resultater i lipemisk plasma blir lavere. Et falskt for lavt resultat på Ddimer kan ha konsekvenser for pasienten. Ved falsk for lav D-dimer kan det føre til at den
fibrinolytiske aktiviteten blir vurdert for lav.
Ut fra resultatene på D-dimer i denne studien kan vi ikke antyde en grenseverdi for lipemiinterferens. Dette kommer av at forskjellen med fortynning III som inneholder minst intralipider var
over grensen for tillatt variasjon. Dermed er det usikkert hvor høy lipemi-indeksen kan være før den
gir utslag på resultatet for D-dimer. Ved videre utvikling av studiet kan det være nyttig å undersøke
lipemi-indeks lavere enn 470 for å se hvor lipider interfererer med metoden.
Svakheter med dette studiet
For å kunne fastsette grenseverdier for AT III og D-dimer må det være flere prøver og paralleller. Å
fullføre dette studiet hadde vært for omfattende for oss. Vi har i samarbeid med fagområdet for
koagulasjon ved Laboratoriemedisin, UNN, utarbeidet en innledning til videre forskning.
En annen svakhet med studiet er at D-dimer har så lav referansegrense slik at det ikke lot seg gjøre
å undersøke lipemi-interferens i normalområdet. Konsentrasjonen av intralipid i fortynningene i vår
studie har vist seg å være for høye i forhold til metodens begrensninger. På grunn av
tidsbegrensninger har ikke vi hatt mulighet til å utarbeide nye fortynninger til D-dimer med lavere
konsentrasjon av intralipid.
22
6 Konklusjon
Det kan tyde på at lipider interfererer med både metoden for AT III og D-dimer. For AT III kan vi
antyde en grenseverdi på ca. 5 g/l intralipider for prøver i patologisk område. I normalområdet så vi
at det interfererte med metoden ved høyere konsentrasjoner, og kan derfor antyde en grenseverdi på
ca. 6 g/l intralipider for prøver i normalområdet. AT III må analyseres uansett for å vite om den er i
patologisk eller i normalt område. Lipemi-indeksen måles automatisk etter nye prosedyrer. Dersom
lipemi-indeksen er lavere enn oppgitte grenseverdier, analyseres prøven for AT III som normalt.
Dersom lipemi-indeksen er over oppgitte grenseverdier må prøven fortynnes og analyseres på nytt.
Den opprinnelige verdien på AT III beholdes dersom den ved fortynning blir omtrent lik
utgangsverdien. Dersom forskjellen mellom den opprinnelige verdien på AT III og den nye verdien
er over tillatt VKa, beholdes verdien etter fortynning.
Vi kan ikke antyde en grenseverdi for D-dimer fordi vi i vår studie har for høy konsentrasjon av
intralipid i fortynningene for D-dimer, og kan derfor ikke vite når lipider interfererer med metoden.
23
Referanseliste
1. Sigrid Johannesen, Overbioingeniør. Lipemi – et pilotforsøk i forhold til å undersøke
hvordan lipider innvirker på prøvesvar. Tromsø. 2014, 12.05.
2. Huseby K.R. Innføring i hemostase (kompendium). Tromsø: Universitetet i Tromsø;
revidert 2011.
3. Rodak B.F, Fritsma G.A, Keohane E.M. Hematology, clinical principles and applications (4.
utgave). St. Louis, Missouri: Elsevier Saunders; 2012.
4. Hoffbrand A.V, Moss P.A.H, Pettit J.E. Haematology, Essential (5. utgave). Oxford:
Blackwell Publishing; 2006.
5. Evensen S.A et.al. Blodsykdommer (6. utgave). Oslo: Gyldendal Akademisk; 2008.
6. Urdal P, Brun A, Åsberg A. Medisinsk Biokjemi, brukerhåndbok (4. utgave). Haugesund:
Akademisk Forlag AS; 2009.
7. Oversiktsbilde av koagulasjonssystemet, Diagnostica Stago.
8. Hillyer C.D et.al. Transfusion Medicine and Hemostasis, Clinical and Laboratory aspects (1.
utgave). London: Elsevier; 2009.
9. STA-LIATEST® D-DI Immunturbidimetrisk bestemmelse av D-dimer. Diagnostica Stago,
Asnières sur Seine: 2012.
10. D-dimer. NEL, Nevrologi. http://tinyurl.com/n8mxhxs (08.05.14)
11. D-dimer. Universitetssykehuset Nord-Norge. http://tinyurl.com/nt3lf7w (23.05.14)
12. Fibrinolyse. UiO Universitetet i Oslo. http://tinyurl.com/lggen62 (25.05.14)
13. M.L.Bishop, E.P.Fody, L.E.Schoeff. Clinical Chemistry - Principles, Techniqes, and
Correlations (7. utgave). USA: LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS; 2013
14. Nikolac N. Lipemia: causes, interference mechanisms, detection and management.
Biochemia Medica. 2014; 24(1):57-67.
15. Pakningsvedlegg: informasjon til brukeren, intralipid. Felleskatalogen.
http://tinyurl.com/l8nn2wl (23.05.14)
16. Blodprøver under pågående TPN-infusjon. Laboratoriemedisin UNN Tromsø.
Dokumentnummer: PR34620. Versjon: 1
17. Serum Indices: Reduction of clinical errors in laboratory medicine. Roche Cobas.
http://tinyurl.com/pa5rzqj (04.05.14)
18. Personlig mail fra Tore Øye (Produktsjef i Roche Diagnostics)
19. How Does the Anticoagulant Citrate work. eHow. http://tinyurl.com/kaf9oqq (07.05.14)
20. Attachment – 6. Stago. http://tinyurl.com/me2dl9h (07.05.14)
21. STA-STACHROM® AT III Kolorimetrisk analyse av antitrombin. Diagnostica Stago,
Asnières sur Seine: 2011.
22. STA-OWREN-KOLLER Owren-koller bufferoppløsning til koagulasjonstester. Diagnostica
Stago, Asnières sur Seine: 2013.
23. STA-SYSTEM CONTROL [N] + [P] Kontrollplasma for test av koaguleringsparametere.
Diagnostica Stago, Asnières sur Seine: 2013.
24. STA-LIATEST® CONTROL [N] + [P] Kontrollplasma til immunturbidimetriske analyser.
Diagnostica Stago, Asnières sur Seine: 2013.
25. Instrumentdokumentasjon STA-R evolution. Laboratoriemedisin UNN Tromsø.
Dokumentnummer: PR4695. Versjon: 1.12
26. Operators manual. Diagnostica Stago S.A.S. Asnières. 0931634A: 2009.
27. Antitrombin III. Universitetssykehuset Nord-Norge. http://tinyurl.com/nnlkyse (24.05.14)
Vedlegg 1: Resultater AT III, patologisk område.
Prøvenr.
Tilsetning
Fortynning
Resultat %
001
Lipid
I
11
001
Lipid
II
15
001
Lipid
III
30
001
Buffer
I
17
001
Buffer
II
21
001
Buffer
III
33
002
Lipid
I
11
002
Lipid
II
16
002
Lipid
III
32
002
Buffer
I
16
002
Buffer
II
19
002
Buffer
III
34
003
Lipid
I
13
003
Lipid
II
18
003
Lipid
III
33
003
Buffer
I
20
003
Buffer
II
23
003
Buffer
III
34
Vedlegg 2: Resultater AT III, normalområde.
Prøvenr.
Tilsetning
Fortynning
Resultat %
004
Lipid
I
18
004
Lipid
II
26
004
Lipid
III
46
004
Buffer
I
24
004
Buffer
II
29
004
Buffer
III
48
005
Lipid
I
18
005
Lipid
II
25
005
Lipid
III
49
005
Buffer
I
25
005
Buffer
II
29
005
Buffer
III
49
006
Lipid
I
18
006
Lipid
II
27
006
Lipid
III
50
006
Buffer
I
25
006
Buffer
II
31
006
Buffer
III
49
Vedlegg 3: Resultater D-dimer, patologisk område.
Prøvenr.
Tilsetning
Fortynning
Resultat µg/ml
007
Lipid
I
0,63
007
Lipid
II
0,52
007
Lipid
III
0,75
007
Buffer
I
0,37
007
Buffer
II
0,33
007
Buffer
III
0,74
008
Lipid
I
0,17
008
Lipid
II
0,42
008
Lipid
III
1,20
008
Buffer
I
0,53
008
Buffer
II
0,82
008
Buffer
III
1,69
009
Lipid
I
0,29
009
Lipid
II
0,68
009
Lipid
III
1,65
009
Buffer
I
1,20
009
Buffer
II
1,65
009
Buffer
III
3,07