Transcript Cristallographie en Biologie - CGE-2014

Cristallographie en Biologie
Beatriz Guimarães
Beamline PROXIMA 1
[email protected]
Ecole Cristallographie et Grands Equipements, Synchrotron SOLEIL, 13-17 Octobre 2014
Les molécules constituantes de la vie
•
Acides nucléiques (ADN, ARN) : contiennent de l’information
génétique
•
Glucides: les principaux intermédiaires biologiques de
stockage et de consommation d'énergie
•
Lipides: les principaux composants des membranes, ils ont
aussi la fonction de stockage d’énergie
•
Protéines: les principaux acteurs des cellules
 les enzymes catalysent des reactions biochimiques essentielles au
métabolisme;
 les protéines peuvent avoir un rôle structurel et méchanique, par
exemple l’actine et la myosine présentes dans les muscles
 d’autres protéines ont un rôle de signalisation cellulaire, réponse
immunitaire, …
Structure des protéines
Les 20 acides aminés
•
Les protéines se différencient par le
nombre et la séquence des acides
aminés qui composent la chaîne
polypeptidique
Structure des protéines
Structure primaire
Structure tertiaire
Structure
quaternaire
Structure
secondaire
Structure des protéines
La plupart des protéines adoptent une
structure tridimensionnelle unique
Les protéines peuvent interagir avec
d’autres protéines, ADN, ARN,
glucides, lipides, …
La Bio-cristallographie
•
La structure 3D d’une protéine peut fournir d’importantes informations sur la
fonction de la protéine et son mécanisme d’action
La Bio-cristallographie
•
1937: M. Perutz commence un projet en ayant pour objectif la détermination
de la première structure cristalline d’une protéine, l’hémoglobine
•
1953: M.Perutz et collègues décrivent l’application de la méthode de
remplacement isomorphe multiple (MIR) pour la détermination de structures
cristallines de protéines
•
1953: J. Watson et F. Crick décrivent la structure en double hélice de l'ADN,
grâce à la technique de diffraction des rayons X (à partir du travail de Rosalind
Elsie Franklin)
•
1958-60: M. Perutz et J. Kendrew résolvent les premières structures
tridimensionnelles des protéines, la myoglobine et l’hémoglobine
•
1962: Prix Nobel de Chimie à J. Kendrew et M. Perutz pour leurs études des
structures des protéines globulaires
•
1962: Prix Nobel de Médecine à J. Watson et F. Crick pour la découverte de la
structure de l’ADN
La Bio-cristallographie
•
La méthode expérimentale la plus utilisée pour déterminer la structure 3D des
macromolécules biologiques à l’échelle atomique
Prix Nobel de Chimie 2009
Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A.
Steitz, Ada E. Yonath
"for studies of the structure and function of
the ribosome"
•
•
Composé de protéines et d'ARN (chez la levure,
79 protéines et ~ 5600 nucléotides pour une
masse de ~ 4 MDa)
Fonction: synthétiser des protéines en décodant
l'information contenue dans l'ARN messager
La Bio-cristallographie
Cristaux de protéine
Analyse de la structure
Diffraction des rayons X
Détermination de la structure, modélisation, affinement
Une expérience
F(h) = |F(h)| eiφ(h)
Intensités mesurées
I(h) = k|F(h)|2
phases φ(h)?
Faisceaux diffractés
goniomètre
Faisceau incident
cristal
h=hkl
I(h) = k |F(h)|2
Molécules
de protéine
ρ(r )  1
Vcell 
h
| F(h) | exp[-2πi(h.r)  iφ(h)]
TF
F(h)  Vcell 
Vcell
ρ(r ) exp[2πi(h.r)] dr
La Bio-cristallographie versus
la cristallographie des “petites molecules”
Macromolécules biologiques
o Quelques centaines à plusieurs milliers d’atomes
o Composées principalement par C N O H (S, P, …)
o Flexibles
Cristaux
o Grande maille
o Grande quantité de solvant
o Mosaïques: désordre interne
Données de diffraction
o Grand nombre de réflexions
o «Faible» intensité
o «Basse» résolution
Détermination de la structure
o Méthodes directes rarement applicables
o Remplacement Moléculaire
o Méthodes basées sur l’incorporation des atomes
lourds
Affinement de la structure
o Faible rapport données/paramètres à affiner
o Application de restrictions géométriques
o Validation du modèle
Les macromolécules biologiques
•
Protéines: polymère de plusieurs dizaines a plusieurs centaines de résidus
•
Structure flexible!
Les cristaux de protéine
•
Dimensions: quelques microns a quelques centaines de
microns
•
Paramètres de maille: des dizaines à des centaines
d’angstroms
•
Empilement cristallin: contact
faible entre les molécules
•
Contenu de solvant : 30-75 %
•
« Mosaicity » (mesure angulaire de l’ordre à longue
distance de la maille dans un cristal) : < 0.2 dégrées a > 1
dégrée
P6522
Les cristaux de protéine
•
65 groupes de espace possibles: PAS de centre
d’inversion ou de plan de réflexion
Sistème cristallin
Groupe
ponctuel
Groupes d’espace
Triclinique
1
P1
Monoclinique
2
P2 P21 C2
Orthorhombique
222
C222 P222 P212121 P21212 P2221 C2221 F222
I222 I212121
Quadratrique
4
P4 P41 P42 P43 I4 I41
422
P422 P4212 P4122 P41212 P4222 P42212 P43212
P4322 I422 I4122
3
P3 P31 P32 R3
32
P312 P321 P3121 P3112 P3221 P3212 R32
6
P6 P65 P64 P63 P62 P61
622
P622 P6122 P6222 P6322 P6422 P6522
23
P23 F23 I23 P213 I213
432
P432 P4132 P4232 P4332 F432 F4132 I432 I4132
Trigonal
Hexagonal
Cubique
Les données de diffraction
•
•
Montage du cristal sur le
goniomètre à l’aide d’une
boucle
Cristal est maintenu sous un
flux d’azote gazeux à 100K
pendant la collecte
Faisceaux
diffractés
Les données de diffraction
•
1ère analyse
 Qualité des données?
 Résolution?
3.6 Å
Les données de diffraction
•
1ère analyse
 Qualité des données?
 Résolution?
Les données de diffraction
•
Stratégie de collecte
 Combien de dégrées?
Complétude, redondance …
 Intervalle de rotation par image?
 Temps d’exposition? Atténuation?
Dommage par radiation …
 Distance du détecteur?
Les données de diffraction
Les données de diffraction
Les données de diffraction
•
Intégration et application des facteurs
de correction aux intensités des
réflexions
•
Un jeu de données: des dizaines de
milliers à des centaines de milliers de
réflexions
I (h k l), σ (I)
h
1
-1
0
1
2
-2
-1
0
1
2
3
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
-4
-3
-2
-1
k
1
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
l
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1371.61
1196.70
231.03
3.78
878.37
452.47
399.54
21.25
239.55
137.99
740.31
193.56
2642.03
646.72
77.68
1267.94
79.31
1181.46
716.08
2995.81
512.31
1109.98
134.64
I
5.89
4.91
1.13
0.25
3.54
2.12
1.95
0.43
1.19
0.95
3.25
1.49
10.99
2.82
0.70
4.69
0.86
5.27
3.52
11.94
2.76
4.95
1.11
La détermination de la structure
ρ(r )  1
Vcell 
h
| F(h) | exp(iφ(h) exp[-2πi(h.r)]
F(h) = |F(h)| eiφ(h)
Im
ϕ(h)?
Intensités mesurées
I(h) = k|F(h)|2
|F(h)|
Re
phases φ(h)?
La fonction densité électronique (r) ne peut pas être déterminée directement à partir
des données expérimentales
La détermination de la structure
•
Remplacement Moléculaire
•
Méthodes basées sur l’incorporation des atomes lourds
•
Méthodes directes
o Relations de phase entre facteurs de structure (normalisés)
o Application: données a haute résolution (< 1.2 Å), petites protéines (~1000
atomes)
Remplacement Moléculaire
• Principes:
 les protéines homologues présentent un repliment similaire
 utilisation d’une structure 3D connue comme modèle initial pour la
détérmination de la nouvelle structure
• Les coordonnées des atomes du modèle se rapportent à un système de référence
donné, c’est à dire, la maille cristalline
• Problème: description de la structure connue (modèle) dans la maille cristalline
de la molécule dont la structure est inconnue
2 etapes: rotation +
translation
?
rnouvelle = Rrmodèle + t
Fonction de Patterson
P(u)   (r )   (r )  
vol .cell
 (r )  (r  u)dr
Fonction d'autocorrélation de la densité électronique
Nous trouvons les pics de la fonction de Patterson quand les vecteurs u
correspondent a des vecteurs interatomiques
y
Une structure 2D de trois
atomes et les pics de
Patterson correspondants
v
2
3
12
1
13
32
x
23
31
21
u
Fonction de Patterson
T[(r)* (-r)] = T[(r)]T[(-r)]
T[P(u)] = [A(h) + iB(h)][A(h) – iB(h)] = |F(h)|2
P(u) =
T-1[|F(h)|2]
P(uvw) 
=

F (h) exp( 2iu  h)dh
=
1
V
 F (h) exp( 2iu  h)
2
2
h
•
Contient de l’information
structural
(vecteurs
interatomiques)
•
Peut être calculée à partir
des données expérimentales
2
2
F
(
hkl
)
cos[ 2 (hu  kv  lw)]

V hk l
Remplacement Moléculaire
• Problème: description de la structure connue (modèle) dans la maille cristalline
de la molécule dont la structure est inconnue
• Comment placer la molecule modèle dans la nouvelle maille?
o Sobreposition des fonctions de Patterson
 Carte de Patterson du modèle calculée à partir des coordonées
 Carte de Patterson de la structure inconnue calculée à partir des
données
2 etapes: rotation +
translation
?
rnouvelle = Rrmodèle + t
Remplacement Moléculaire
cristal
• Pour N atomes dans la maille, la carte de
Patterson présentent N2-N pics
•
Pour chaque orientation/position, des
facteurs de corrélation sont calculés
carte de Patterson
2
2
C
2
hkl
2
[  ( Fobs (hkl) 2  Fobs (hkl) 2)
hkl
•
2
 ( Fobs (hkl)  Fobs (hkl) )  ( Fcalc (hkl)  Fcalc (hkl) )
2 1/ 2
2
2
( Fcalc (hkl)  Fcalc (hkl) ) ]

hkl
Solution: contraste entre le facteur de
corrélation calculé à partir d’une
orientation/position donnée et les
autres
Remplacement Moléculaire
Possibles sources de problème:
• basse similarité de sequence (“preparation” du modèle)
• empilement cristallin très compact
• molécules “alongées”
• flexibilité entre domaines
...
Remplacement Isomorphe et Diffraction Anomale
•
Méthodes basées sur l’incorporation des atomes lourds dans le cristal (dérivés
d’atomes lourds)
•
Im
αP?
|FP|
Re
L’incorporation des atomes lourds va provoquer un
changement du facteur de structure qui va être utilisé
pour la résolution du problème des phases
Remplacement Isomorphe et Diffraction Anomale
•
Méthodes basées sur l’incorporation des atomes lourds dans le cristal (dérivés
d’atoms lourds)
•
L’incorporation des atomes lourds va provoquer un
changement du facteur de structure qui va être utilisé
pour la résolution du problème des phases
Im
αP?
|FP|
Re
•
1ère étape: détermination de la position des
atomes lourds
Remplacement Isomorphe et Diffraction Anomale
•
Multiple Isomorphous Replacement
(MIR) : enregistrement des données d’un
cristal natif et de deux ou plus dérivés
d’atomes lourds
•
Multiple
Wavelength
Anomalous
Diffraction (MAD): enregistrement des
données d’un cristal dérivé à des
longueurs d’onde choisies
Diffraction Anomale à Multiples Longueurs d’Onde (MAD)
•
Facteur de structure: description de la diffusion par la maille du cristal
N
F(h)   f j exp( 2irj.h)
j1
•
Diffusion “normale”
 Le facteur de diffusion atomique fj décrit la diffusion par un atome isolé
considerant des életrons libres
 fj est réel et independant de la longueur d’onde du rayonnement incident
•
•
Electron non-libre: résonance
entre le rayonnement incident et
l’onde électromagnétique du
dipôle oscillant
A
certaines
énergies
du
rayonnement incident (proche
d’un seuil d’absorption) la
diffusion “anomale” se produit
électron -
δ+
δ+
noyaux
δ+
électron non-libre
dipôle oscillant
δ-
Diffraction Anomale à Multiples Longueurs d’Onde (MAD)
•
Facteur de diffusion atomique: fj = f0 + f(λ) + if’’(λ) = f’(λ) + if”(λ)
 fj est complexe et depend de la longueur d’onde du rayonnement incident
Im
λƒ"(h)
λƒ'(h)
F(h)
•
F˚(h)
La loi de Friedel n’est plus valable
I (h) ≠ I(-h)
Re
F(-h)
λƒ"(-h)
λƒ'(-h)
F˚(-h)
Diffraction Anomale à Multiples Longueurs d’Onde (MAD)
15
ƒ" m aximised
at "w hiteline"
optim ised SIRA S
Se K-edge of SeO
24
10
ƒ"
Electrons
5
-5
high ƒ" rem ote
max ƒ"
0
m in ƒ'
M AD
low ƒ" remote
ƒ'
-10
-15
12600
(0.9840Å)
12650
(0.9801Å )
12700
(0.9763Å)
12750
(0.9724Å)
12800
(0.9686Å )
Energy (eV)
fj = f’(λ) + if”(λ)
• Longueurs d’onde de la collecte choisies pour
maximiser:
 Différences anomales: F(h)+, F(h) Différences dispersives: F(h)λ1, F(h)λ2
Construction et affinement du modèle
•
Détermination de la structure
cristalline: calcul d’une carte de
densité électronique
ρ(r )  1
Vcell 
h
| F(h) | exp(iφ(h) exp[-2πi(h.r)]
Construction et affinement du modèle
•
Détermination de la structure
cristalline: calcul d’une carte de
densité électronique
ρ(r )  1
Vcell 
h
| F(h) | exp(iφ(h) exp[-2πi(h.r)]
Construction et affinement du modèle
Carte de densité
électronique initiale ρ(r)
Fo, αc0 → ρ1 (r)
Construction et affinement du modèle
Carte de densité
électronique initiale ρ(r)
Fo, αc0 → ρ1 (r)
Modèle initial (coordonnées
atomiques)
Affinement du modèle, calcul
de nouvelles phases
F1, αc1 → ρ2 (r)
Construction et affinement du modèle
•
•
Affinement classique: 4 paramètres par atome (x, y, z, B)
Faible rapport: données (nombre de réflexions uniques) / paramètres à affiner
CRYST1
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
55.490
1 O
2 N
3 CA
4 C
5 N
6 CA
7 C
8 O
9 CB
10 CG1
11 CG2
55.490 115.220 90.00 90.00
GLY A 14
22.936 17.256
GLY A 14
24.991 16.909
GLY A 14
23.796 17.660
GLY A 14
22.679 17.528
VAL A 15
21.433 17.718
VAL A 15
20.261 17.642
VAL A 15
19.320 16.530
VAL A 15
18.962 16.479
VAL A 15
19.506 19.004
VAL A 15
18.372 18.906
VAL A 15
20.451 20.146
x
Facteur de Debye-Waller, Facteur B
y
90.00 P 43
42.286 1.00 38.76
40.481 1.00 41.17
40.098 1.00 39.33
41.111 1.00 37.45
40.675 1.00 28.46
41.555 1.00 24.14
41.094 1.00 26.85
39.915 1.00 25.35
41.696 1.00 24.54
42.716 1.00 22.66
42.077 1.00 23.79
z
B(Å2)
50.0
40.0
30.0
25.0
u(Å)
0.80
0.71
0.62
0.56
Construction et affinement du modèle
•
•
Restrictions géométriques: paramètres stéréochimiques sont utilisés pour
augmenter le rapport données / paramètres à affiner
Fonctions de restriction: distance/angles de liaison, planarité, interactions non
covalantes, …
• Moindres carrés
•
Maximum de
vraisemblance
Construction et affinement du modèle
•
Les facteurs B isotropes ne décrivent pas convenablement le modèle
•
La description anisotrope introduit 6 paramètres par atome
•
TLS (Translation/Libration/Screw) : la chaine polypeptidique est divisée en
segments; mouvement anisotrope des groupes d’atomes corrélés
•
Introduction de 20 paramètres en plus par groupe dans l’affinement;
amélioration significative de la qualité du modèle
Biso
Baniso
TLS
Construction et affinement du modèle
•
La question de la résolution des données
1.5 Å
2.8 Å
Construction et affinement du modèle
•
La question de la résolution des données
 niveau de détail de la carte
 nombre de réflexions uniques utilisées pour l’affinement (8x plus de réflexions dans
un jeu a 2 Å que dans un jeu à 4 Å)
1.5 Å
2.8 Å
Construction et affinement du modèle
Carte de densité électronique ρ(r)
Fo, αc0 → ρ1 (r)
• Paramètres géométriques et accord
avec données expérimentales
• Minimisation du facteur résiduel
Espace réel: ajustement du
modèle à la densité électronique
Rfactor
F F


F
obs
calc
obs
Rfree
F F


F
obs
calc
obs
Espace réciproque: affinement des
paramètres du modèle, calcul de
nouvelles phases
Validation du modèle
•
•
•
•
•
Géometrie des liaisons covalentes
Planarité
Angles dièdres
Interactions non covalentes
Ponts dissulfures
Diagramme de Ramachandran
Validation du modèle
Déposition des coordonées du modèle et facteurs de
structure
Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
La Bio-cristallographie
Cristaux de protéine
Analyse de la structure
Diffraction des rayons X
Détermination de la structure, modélisation, affinement
Interpretation du modèle
•
Description de la fonction? Description d’un mécanisme chimique? Description
d’un mécanisme moléculaire?
• Structure
de
la
riboflavin synthase à 1.8
Å de résolution: étude
détaillé de l’interaction
avec des ligands
• Structure
d’un
régulateur
de
transcription à 3.2 Å de résolution:
relation entre l’activité de la protéine et
son structure quaternaire
Questions?
Prix Nobel de Chimie 2009
Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A.
Steitz, Ada E. Yonath
"for studies of the structure and function
of the ribosome"
Le problème des phases
faisceaux diffractés
φ(h)
cristal
|F(h)|
F(h) = |F(h)| eiφ(h)
Intensités mesurées
I(h) = k|F(h)|2
phases φ(h)?
faisceau incident
La fonction densité électronique (r) ne peut pas être déterminée directement à partir
des données expérimentales
Diffusion “normale”
Diffusion par des életrons libres, facteur de diffusion atomique independent de la
longueur d’onde
Free Electron
Incoming X-ray
Diffracted X-ray
Diffusion “anomale”
Diffusion par des életrons non-libres, facteur de diffusion atomique dependent de
la longueur d’onde
Bound Electron
Incoming X-ray
Diffracted X-ray
Diffusion “anomale”
L’introduction d’un diffuseur “anomale” dans le cristal provoque des differences
dans le facteur de structure
Prix Nobel de Chimie 1997
Paul D. Boyer, John E. Walker, Jens C.
Skou
"for their elucidation of the enzymatic
mechanism underlying the synthesis of
adenosine triphosphate (ATP)"
http://www.mrc-mbu.cam.ac.uk/research/atp-synthase
Prix Nobel de Chimie 2006
Roger D. Kornberg
"for his studies of the molecular basis of
eukaryotic transcription"
Prix Nobel de Chimie 2012
Robert J. Lefkowitz ,Brian K. Kobilka
"for studies of G-protein-coupled receptors"
Crystal structure of the β2 adrenergic
receptor–Gs protein complex