5_Roscoff_CM2_Anomal - Station Biologique de Roscoff

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2. La fonction de Patterson

2.3. Applications de la fonction de Patterson ( 2) Patterson isomorphe et (3) Patterson anomale

•

Voir partie (3) et partie (4) (4) Section de Harker

•

Important pour les Patterson isomorphe et anomale

Les éléments de symétrie de la maille cristalline peuvent engendrer des pics dans certains plans ou sections particulières

Section de Harker Les coordonnées des vecteurs interatomiques entre 2 mêmes atomes reliés par la symétrie du cristal peuvent présenter des particularités

2. La fonction de Patterson

2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker Exemple : groupe d’espace P2 1 (2 positions équivalentes)

Matrice d’interaction :

Déterminer les coordonnées des

vecteurs interatomiques

entre atomes reliés par symétrie (chaque atome existe en position 1 et 2)

x y z -x y+1/2 -z x y z 0 0 0 2x -1/2 2z -x y+1/2 -z -2x +1/2 -2z 0 0 0

Les vecteurs interatomiques entre positions symétriques présentent des coordonnées uvw particulières : ± 2x ± 1/2 ±2z

2. La fonction de Patterson

2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker Les pics correspondants appartiennent tous à un plan

v = 1/2 = SECTION DE HARKER

w maille u P(u,1/2,w) v 2x 1/2 2z -2x 1/2 -2z 2 pics

Carte des vecteurs interatomiques en v = +1/2

1 atome

2. La fonction de Patterson

2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker La section de Harker dépend du groupe d’espace - pas de symétrie : - axe de rotation selon b: - axe de rotation selon c : - axe hélicoïdal 2 1 - axe hélicoïdal 3 1 - axe hélicoïdal 4 1 - etc … selon b : selon c : selon c : pas de section de Harker section de Harker en v = 0 section de Harker en w = 0 section de Harker en v = 1/2 section de Harker en w = 1/3 section de Harker en w = 1/4

3. LA DIFFUSION ANOMALE

Solution du problème de phase Remplacement moléculaire Modèles similaires

Méthodes directes temps de calculs; très haute résolution Remplacement isomorphe Addition d’atomes lourds Résidus réactifs; variations de l’intensité

MIR

Diffusion anomale à longueur d ’ondes multiples

MAD

L’effet anomale varie l’intensité; dépendence de la longueur d’onde X

Nouvelle structure

versus

nouveau repliement

La « Protein Data Bank »

87 244 8867 8290 11 395 2234 Year 486

remplacement moléculaire

La cryo-cristallographie et l’augmentation de l’accès à des lignes de lumières adaptées, mène de plus en plus vers la resolution des structures par la méthode MAD .

Rappel : imaginaire F

P 



?

réel F

=  F  a = 

e

i a

=  r (x,y,z) e

i2  (hx+ky+lz) a

Construction de Harker ou Diagramme de Argand

3. La diffusion anomale

3.1. Absorption des rayons X

•

Le phénomène d’absorption

Définition

Diminution de l’intensité du rayonnement X lorsqu’une matière est traversée. Cette diminution suit une loi de décroissance exponentielle en fonction de la longueur traversée.

I 0 Exemples de l 1/2 I 0 /2 l 1//2

l = Longueur traversée

l Air Aluminium Plomb 4,1 m 0,5 mm 4 µm

Applications Protection contre le rayonnement Ecrans absorbants de protection en plomb

3. La diffusion anomale

3.1. Absorption des rayons X

•

Variation du coefficient d’absorption

L’absorption se mesure en fait par le coefficient d’absorption massique (µ/ρ), caractéristique de chaque élément chimique Il varie avec le numéro atomique Z et la longueur d’onde

Variation de µ/ρ en fonction de la longueur d’onde

variation brutale au niveau des longueurs d’ondes d’émission correspondant à l’énergie nécessaire pour extraire des électrons d‘une couche donnée

Ces discontinuités correspondant aux énergies d'extraction des électrons des couches K, L1, L2, etc…

1s K 2p L

Les différents seuils d ’absorption

M 3d Les différents seuils d ’absorption correspondent aux différentes couches électroniques excitées Absorption au seuil fort/mesurable (ligne blanche) surtout pour les éléments à électrons de la couche

3. La diffusion anomale

3.1. Absorption des rayons X

•

Application de l’absorption des rayons X Résolution de structures de macromolécules en cristallographie biologique Seuil d’absorption

Donc lorsque négligeable  incident   seuil : Le phénomène d’absorption n’est plus Pour  incident  1 Å, seuls les atomes lourds présentent une absorption non négligeable

DIFFUSION ANOMALE

3. La diffusion anomale

3.2. Le facteur de diffusion atomique

• Dans l’expression du facteur de diffusion f

diffusion d’un électron libre j , on néglige l’attraction du noyau sur les électrons (on les considère libres)

• Un calcul plus rigoureux impose une correction par rapport à la Modèle de l’électron libre f 0 f j = facteur de diffusion de l’atome j f j = f° Modèle réel : Diffusion anomale

absorption

f 0 f" f’ f j = facteur de diffusion de l’atome j f j = f° + f’ + i f" f’ : terme dispersif f" : terme d’absorption

Le facteur de diffusion atomique est complexe

3. La diffusion anomale

3.2. Le facteur de diffusion atomique

• • • Dès que f’ et f’’ ne sont plus négligeables = diffusion anomale C’est le cas lorsque Pour  incident  1 Å, seuls les atomes lourds présentent une absorption non négligeable  incident   seuil

Variation en fonction de la résolution λ (Å) 34 f o Se E (eV) 6 A haute résolution la diffusion anomale est plus importante f o diminue f’ et f" quasi-constants f" résolution

Tableau des éléments pour les seuils d’absorption

element: Mg Edge keV Å K 1.3050 9.5007

http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html

scattering factors data file Mg.dat

K 4.0381 3.0704

element: Fe Edge keV Å K 7.1120 1.7433

scattering factors data file Fe.dat

L-I 14.8393 0.8355

L-II14.2087 0.8726

L-III 12.2839 1.0093

scattering factors data file Ca.dat

M1 1.0721 11.5646

scattering factors data file Hg.dat

element: S Edge keV Å K 2.4720 5.0155

scattering factors data file S.dat

K 12.6578 0.9795

L-I 1.6539 7.4965

L-II 1.4762 8.3989

L-III1.4358 2.7207

K 33.1694 0.3738

scattering factors data file I.dat

M1 1.0721 11.5646

scattering factors data file I.dat

L-II 9.9782 1.2426

L-III 8.9436 1.3863

M1 2.3981 5.1701

M2 2.1730 5.7057

scattering factors data file Yb.dat

Phasage par MAD

point d ’inflection seuil

disp h k l h k l

ano h k l

lointaine



-h -k -l



2 F ph+ hkl





ano

energy

disp f



F ph -h-k-l

2

F ph+ hkl

3

F ph+ hkl

1

F ph+ hkl

1

F ph hkl

3

F ph hkl

2

F ph hkl Violation de la loi de Friedel

3. La diffusion anomale

3.3. Conséquence de la diffusion anomale

Im F

F F

-F F’’

-F

Pour les atomes lourds f a = f° a + f’ a + i f" a

Re F

On pose f a = f° a +

f’ a

F =  f o P F =  f P e i  P e i  P +  (f a +  f a + if" a ) e i  a e i  a + i  f" a e i  a F = Fp + Fa + iF"a

-F

a i(a - ib) a + ib i(a + ib) Fp Fa F"a

-F’’

a a - ib

3. La diffusion anomale

3.3. Conséquence de la diffusion anomale

Im F

F F

-F F’’

-F

a Re F Im F

F F

F’’

-F’’

-F

Re F

-F’’

La loi de Friedel n’est plus respectée

Quand est-ce que la méthode MAD est faisable ?

Estimation de la « force » du signal anomal/dispersive

Différence dispersive maximale :

f’



i – f’



max Différence anomale maximale : 2f’’ max En fractions de

<| Fp |> = √ ∑

f 02

Approximation pour <| Fp |> ≈ ou

6.7

√ (nombre d’atomes) √ (3.14 x poids moléculaire)

Donc :

√ N 2 ano x |

f’



i – f’



<| Fp |> |

max signale différence dispersive

√ N ano 2 x

2f’’ max

<| Fp |>

signale différence anomal

3. La diffusion anomale

3.4. Principe de la méthode

D



ano =



F hkl

  

F -h –k -l



Il est basé sur la modification de la diffraction lorsqu’un ou plusieurs diffuseurs anomaux sont présents dans le cristal, cad sur la différence d’intensité d’une paire de Bijvoet

On définit la fonction de Patterson suivante

P(uvw) =



avec (

D



ano ) 2 ΔF ano cos (2



(hu + kv + lw)) = Σ ΔF’’ = Fonction de Patterson définissant une carte dont les pics sont les vecteurs interatomiques entre diffuseurs anomaux uniquement

3. La diffusion anomale

3.4. Principe de la méthode Les diffuseurs anomaux sont localisés dans la section de Harker 1 u Cartes de Patterson (unité asymétrique) de différence anomale expérimentale Groupe d’espace P2 1 0 1/2 w La déconvolution de la fonction de Patterson ou les méthodes directes permet de déterminer les positions des diffuseurs anomaux f A x A ,y A ,z A TF F Acalc

, φ Acalc

3. La diffusion anomale

3.5. Méthodologie

• Introduction de diffuseurs anomaux dans le cristal ou directement dans la protéine – Atomes lourds – Développements de cette technique : utilisation de la sélénométhionine méthionine sélénométhionine S C a 16 e -

Protéine Native

C a 34 e -

Protéine Séléniée

3 F ph+ hkl

3. La diffusion anomale

1 3 1 F ph+ hkl F ph hkl F ph hkl hkl F ph-

3.5. Méthodologie

   

Phasage MAD

Introduire un diffuseur anomal Aller au synchrotron sur une ligne adapté au MAD Mesurer le seuil d’absorption (sur un premier cristal) Collecter trois différents longueurs d’onde  Connaître le groupe d’espace  Mise à l’échelle entre DIFFERENTS longueur d’ondes avec

SCALA

(CCP4)  Déterminer les sites du diffuseur anomal (PATTERSON anomal ; dispersive)  Mettre les sites et les données dans un programme de phasage

3. La diffusion anomale

3.5. Méthodologie

(1) SAD : Single Anomalous Dispersion

Collecte d’un jeu de données à 1 longueur d’onde : on se place à la longueur d’onde pour laquelle f" est maximal Pb : ambiguïté sur les phases (voir 3.6), méthode efficace uniquement pour des données de bonnes qualités

(2) MAD : Multiple Anomalous Dispersion

Collecte de 3 jeux de données à 3 longueurs d’onde 1. f" maximal 2. f’ maximal 3. loin du seuil d’absorption (pas d’effet anomal)

3. La diffusion anomale

3.6. Détermination des phases

Im F

F F

F’’

-F’’

-F F

P Re F

On dispose de :

- modules de F+ - modules de F- - modules et phases de F

- modules et phases de F"

a F P ? tels que F+ F = Fp = Fp + Fa + Fa + iF"a iF"a Construction de Harker

3. La diffusion anomale

3.6. Détermination des phases

axe imaginaire H K

F PL(-)

-F" L -F’ L O F" L axe réel

F PL(+) Pour chaque réflexion hkl Construction de Harker

3. La diffusion anomale

3.6. Détermination des phases

F PL(-)

H -F" L -F’ L O F" L axe imaginaire

A partir de la position des diffuseurs anomaux, on peut déterminer φ P pour chacune des réflexions F P

, φ

P TF -1 x P ,y P ,z P F PL(+)

Stratégies de collectes selon le groupe d’espace

P1 P2 1 P2 1 2 1 2 1

1 (Laue class)

h k l → -h –k -l paires de Friedel tous les 180°

Collecte 360° 2/m mmm

h k l → -h k –l → h –k l h k l → -h -k l paires de Friedel sur même image →

Collecte 180° Collecte 90°

h k -l P3 1 P3 1 21 P6 2

h k l → k-h -h l → h-k h -l paires de Friedel tous les 60°

Collecte 2x60° 3m

h k l → k h l → -k -h l paires de Friedel tous les 30°

Collecte 2x30° 6/m

h k l → -h -k l → h k -l paires de Friedel sur même image

Collecte 60°

3 F ph+ hkl

Avantages – Inconvénients de la méthode MAD

1 F ph+ hkl 3 1 F F ph 2 ph hkl F ph hkl hkl  Idéale si protéine contient diffuseur anomal  Si protéine recombinante – production Se-met  Un marquage suffit avec plusieurs   Besoin du synchrotron pour varier   Les cristaux ne tiennent pas toujours pour la collecte complet

Le traitement des erreurs

P j ( a ) | F PH | | F H | | F P | Hendrickson-Lattman coefficients (A,B,C,D) P j ( a ) P j ( a ) 0 a D 2π 0 a D 2π 0 a D 2π

Le traitement des erreurs distribution gaussienne

Q =  w (|F o |–|F c |) 2

Moindre carrées:

Supposition que la distribution des erreurs et gaussienne.

Faux, quand les erreurs sont large.

intégration de la

vraisemblance

de la réponse

Maximum Likelihood :

- meilleur estimation de la probabilité - incorporation de toutes sort d’information (erreurs, données absents, i.e. free)

distribution de ‘Rice’

Quand choisir quelle méthode de phasage ?



RM

quand on a un modèle homologue (~>30%)  a essayer presque en tous les cas, même si inférieur 

MAD

quand on produit la protéine de façon recombinante – production de la protéine séléno-méthioné 

MAD

quand la protéine contient de façon naturel des bons diffuseurs anomal (Fe, Zn, Cu) ou des atomes facilement échangeable (Ca, Mg, Mo)  SAD quand le cristal ne tient pas pour 3 longueurs d’ondes au complet 

SIRAS

quand on réussit d’obtenir un bon dérivé avec un atome qui est bon diffuseur anomal 

MIRAS, MIR

quand tous le reste ne marche pas

(avec connotation « historique »)         

MIR – marquage avec atomes lourds M.Perutz 1956, Kendrew 1958 MAD – un seul dérivé (ou diffuseur naturel) avec synchrotron Wayne Hendrickson 1988,91 SIR, SIRAS - ‘Maximum Likelyhood’ G.Bricogne, de la Fortelle 1997 Se-MAD introduction d’une sonde ‘systématique’ par biologie moléculaire W.Hendrickson 1995-1997 SAD R.Read, Z.Dauter 1999-2002 Xénon M.Schiltz, G.Bricogne 1997 Iode (I 3 ), complexe au Gadolinium Sulfur (and Ca 2+ ) SAD Evans,Bricogne 02 et R.Kahn 03 Yang 2003 Triangle ‘magique’ (3 I) Beck, G.Sheldrick 2008 Acta Cryst D Vol 59 (11) CCP4 study weekend 2003

MIR et MAD, (MIRAS, SAD, SIRAS….) et méthodes directes



Crank; DM; arp-warp CCP4i



Solve ; Resolve Phenix



SHARP; Solomon autoSHARP



Phases ; (XtalView)



CNS CNS



SnB (Shake and Bake)

Methodes directes



SHELX c,d,e – hkl2map



(………)

3. La diffusion anomale

3.7. Conclusions

Avantages

Un seul cristal est nécessaire pas de défaut d’isomorphisme La sélénométhionine, ou tout diffuseur anomal lié covalemment, est un point d’ancrage pour la construction de la structure pas de problème d’occupation Phasage à haute résolution

3. La diffusion anomale

3.7. Conclusions

Inconvénients

Signal anomal faible par rapport aux intensités collectées - il faut 1 Me pour 8 kDa L’accès aux sources synchrotron est nécessaire utilisation de Gd sur anode tournante

3. La diffusion anomale

3.7. Conclusions

Erreurs sur les phases

Calcul des phases par distribution Gaussienne de probabilité de phase

Combinaison des méthodes

Remplacement isomorphe et diffusion anomale

SIRAS, MIRAS

4. LE REMPLACEMENT ISOMORPHE

4. Le remplacement isomorphe

4.1. Principe de la méthode Il est basé sur le changement d’intensité causé par la présence d’un atome lourd dans la molécule (F H ,



H ) Atome lourd cristal dérivé F PH cristal natif F P « cristal différence » cristal virtuel F H

4. Le remplacement isomorphe

4.1. Principe de la méthode Hypothèse de base

le cristal de la structure native et du dérivé lourd doivent être isomorphes :

la symétrie cristallographique et les paramètres de maille sont conservés la molécule n’a subi ni rotation ni translation dans la maille

pour pouvoir générer le « cristal différence »

4. Le remplacement isomorphe

4.1. Principe de la méthode Pour chaque réflexion hkl

F hkl =  P f P e 2  i (hx

+ ky

+ lz

) +  H f H e 2  i (hx

+ ky

+ lz

)  F P  e i 

P Atomes légers

 F H  e i 

H Atomes lourds

F

PH = F P + F H

F PH F H F P = facteur de structure du cristal dérivé = facteur de structure des atomes lourds = facteur de structure de la protéine

4. Le remplacement isomorphe

4.1. Principe de la méthode

Il faut disposer de jeu natif plusieurs jeux de données : = cristal de protéine seule (F P ) un ou plusieurs dérivés lourds = cristaux de protéine + atomes lourds (F PH ) Hypothèse de base Si les cristaux sont isomorphes, les F P sont les mêmes dans l l F P =  P f P e 2  i (hx

+ ky

+ lz

) F PH =  P f P e 2  i (hx

+ ky

+ lz

) +  H f H e 2  i (hx

+ ky

+ lz

)

4. Le remplacement isomorphe

4.2. Méthodologie

• • • • • • • Préparation des cristaux de dérivés lourds Enregistrement espaces complets de diffraction – de la structure native – du (des) dérivé(s) lourd(s) Mise à l’échelle des jeux natif/dérivé(s) Détermination de la position des atomes lourds Affinement des paramètres des atomes lourds Calcul des phases (probabilité de phases) Calcul d’une carte de densité électronique

4. Le remplacement isomorphe

4.2. Méthodologie Obtention des dérivées lourds

• • • • • Classiquement obtenus par trempage des cristaux Les composés lourds diffusent dans le cristal à travers les canaux de solvant Ils peuvent se fixer sur des sites précis – Ex : composés Hg réagissent avec les Cys accessibles et réduites à pH neutre Cette étape est souvent longue et fastidieuse Autre méthode possible : incorporation d’un atome lourd avant cristallisation – Ex : Sélenométhionine cf diffusion anomale

4. Le remplacement isomorphe

4.2. Méthodologie

•

Choix des atomes lourds Kit Hampton Research

4. Le remplacement isomorphe

4.2. Méthodologie

• • • •

L’incorporation de l’atome peut perturber l’empilement cristallin défaut d’isomorphisme Lorsque le défaut d’isomorphisme est important, les F ne sont plus équivalents P Le défaut d’isomorphisme augmente avec la résolution En général : Trouver la zone de résolution pour laquelle le cristal dérivé est isomorphe

4. Le remplacement isomorphe

4.3. Détermination de la position des atomes lourds

b 0 a

Protéine native

Atome lourd

Protéine substituée (« isomorphe »)

4. Le remplacement isomorphe

4.3. Détermination de la position des atomes lourds

D



F iso PH = =



F F P PH + F H

  

F P

 On définit la fonction de Patterson suivante : Calculée sur les données de diffraction issues de 2 cristaux (natif et dérivé)

P(uvw) =



(

D



iso ) 2 cos (2



(hu + kv + lw)) avec (

D



iso ) 2 ~ |F H |2 = Fonction de Patterson définissant une carte dont les pics sont les vecteurs interatomiques entre atomes lourds « uniquement »

4. Le remplacement isomorphe

4.3. Détermination de la position des atomes lourds Les atomes lourds sont localisés dans la section de Harker 2x 1/2 2z -2x 1/2 -2z Exemple : P2 1 2 pics dans la section de Harker v = 1/2 dus à 1 atome lourd La déconvolution de la fonction de Patterson permet d’avoir la position des atomes lourds f H x H ,y H ,z H TF F Hcalc

, φ Hcalc

4. Le remplacement isomorphe

4.4. Détermination des phases

Axe imaginaire H

F P

F

PH ? tels que = F P + F H On dispose de :

- module de F

- module et phase de F

- module de F

J F P -F H O F H G F PH Axe réel

Construction de Harker

4. Le remplacement isomorphe

4.4. Détermination des phases

F PH 2 Axe imaginaire H

F P ,φ P Avec un deuxième dérivé, on lève l’ambiguïté de phase

-F H 2 J F P -F H O F H G Axe réel F PH

4. Le remplacement isomorphe

4.4. Détermination des phases Pour chacune des réflexions on peut déterminer φ P

F

, φ

P TF -1

x

,y

,z

2 méthodes

SIR : « Single Isomorphous Replacement »

1 cristal natif + 1 seul cristal dérivé

MIR : « Multiple Isomorphous Replacement »

1 cristal natif + Plusieurs cristaux dérivés (>2)

Remarque :

on peut combiner remplacement isomorphe et diffusion anomale (voir diapo suivante)

4. Le remplacement isomorphe

4.5. Combinaison des 2 méthodes

H axe imaginaire

F P Principe de la méthode SIRAS

F PH(-)

-F" H -F’ H O F" H axe réel - 1 cristal natif - 1 cristal dérivé

contenant des atomes lourds qui sont diffuseurs anomaux F PH(+)

4. Le remplacement isomorphe

4.6. Erreurs sur les phases

Sources d’erreurs - coordonnées (x,y,z) des atomes lourds - amplitudes des F mesurés (F P et F PH ) - défaut d’isomorphisme Erreur de fermeture : hypothèse : F PH

ε F PH F H

+ ε ε = |F PHobs | - |F PHcalc |

F P

ε = |F PHobs | - |[|F P |e iφ P + |F H | e iφ H ]

Les erreurs sont traitées avec des méthodes statistiques L’erreur de fermeture est utilisée pour définir une probabilité de phase (voir document)

4. Le remplacement isomorphe

4.6. Erreurs sur les phases Hypothèse : les erreurs sont distribuées selon une Gaussienne Cas du SIR P

F P

φ best 70 330 Probabilité d’une phase de présenter une certaine valeur S’il y a n dérivés, les probabilités de phase des différents dérivés sont multipliées

4. Le remplacement isomorphe

4.6. Erreurs sur les phases La qualité de l’information sur chaque phase est mesurée par la figure de mérite (m ou fom) qui est le reflet de l’étroitesse de la distribution de probabilité : - m = 1 : distribution étroite - m = 0 : distribution plate φ best = 200 ° m = 0.23

Δφ = 76 ° m = cos Δφ Cartes de densités m hkl F p e i α best φ best = 328 ° 3 dérivés m = 0.95

Δφ = 18 ° 330 centroïde de la distribution = phase la meilleure φ best