Transcript UE8 ingénierie des tissus cranio

PACES1 2013-2014
UE8 ingénierie des tissus cranio-faciaux
Quelles sont les différentes techniques
qui permettent l’étude puis l’identification
des acteurs génétiques impliqués
dans la formation et la différenciation
du massif cranio-facial ?
Dr. F. Perrin-Schmitt
poulet
1) Embryologie descriptive et
embryologie expérimentale
grenouille
chimères (caille/poulet)
2) Obtention de modèles génétiques expérimentaux
- infection par des retrovirus
- transgénèse générale
- transgénèse ciblée
Souris
3) Modèles in vitro
- cultures cellulaires
- ingénierie tissulaire
BioMaterials
BioEngineering
UMR-S 1121
Strasbourg
8DF1-14 avril 2014
Poisson-zèbre
Suivre
la migration et la différenciation des cellules,
la formation des précurseurs d’un tissu,
et le développement d’une structure
au cours du développement.
est crucial
pour comprendre les interactions et les signalisations
qui contrôlent et conduisent
au développement des structures morphologiques
et à l’acquisition d’organes fonctionnels.
Observer et étudier le développement embryonnaire
permet d’établir des « cartes des territoires présomptifs »
(ou « fate maps »),
utiles pour appréhender l’origine d’anomalies morphologiques ou fonctionnelles.
OUTILS :
Trouver des marqueurs spécifiques,
permettant de tracer les cellules,
de leur origine à leur destination finale.
Différents types et techniques de marquage des cellules et tissus :
de
l’embryologie
descriptive
de
l’embryologie
expérimentale
TECHNIQUES :
Tester les conséquences
- de l’ablation ou du remplacement
de groupes de cellules,
- de la présence de substances
agonistes ou antagonistes
C’est aussi un pré-requis
pour développer des stratégies palliatives et/ou curatives.
Apports
- des dysfonctions génétiques.
de
modèles
transgéniques
de
modèles
in vitro
Marqueurs naturels des cellules
Observations de tissus (vivants) / fixés
Marqueurs :
- Marqueurs cytologiques naturels
- Colorants vitaux
- Radioactivité
- Marqueurs fluorescents / réactions colorées
- Gènes reporters (trangénèse, injection de retrovirus)
- des granules pigmentés
(axolotl : CCNC pigmentées, paraxial pas pigmentées
xenope : greffes CCNC -> albinos),
- morphologies nucléaires distinctives,
- présence d’inclusions de vitellus (salamandre, de Beer, 1947 : première mention
que l’ecto-mésenchyme contribue à former os (mâchoire inférieure)
- Révélation du marquage sur tissus fixés :
- radioactivité, immunocytochimie
- gène reporter (lacZ)
- Révélation du marquage de cellules ou organismes vivants :
- après injections (colorants, retrovirus exprimant GFP)
- marqueurs génétiques (fluorescence : GFP).
Albinos / pigmenté
Greffon pigmenté / hôte albinos
Marquage radioactif des cellules
Utilisation de colorants vitaux
Observations de tissus vivants
Observations de tissus fixés
Vogt (1925) : tampon d’agar agar imprégné de bleu de Nil et/ou de rouge neutre
2
1
3
Vers 1960, Weston et Chibon utilisèrent
le marquage radioactif à la thymidine tritiée 3H
des noyaux d’embryons de poulets et d’amphibiens.
L’autoradiographie des échantillons permet de mettre en évidence
la migration des cellules et de leurs dérivées.
Vue dorsale
Gastrulation du xénope
Ce type de marquage souffre
de la dilution et l’affadissement du signal
dûs aux divisions cellulaires successives.
Vue latérale
V
D
Problèmes:
- Les colorants vitaux, passent de cellule à cellule; se diluent rapidement...
- Les particules de carbone tombent des cellules,
passent chez les cellules voisines.
De plus : mort cellulaire,
la radioactivité peut être incorporée
dans les cellules voisines
d’où erreurs d’interprétations.
Noden 1975
Marquages fluorescents
Marquage spécifique des cellules
Observations de tissus fixés
Observations de tissus vivants
Injection dans cellules individuelles
Marquage des protéines
par des anticorps spécifiques
Marquage des membranes :
Colorant lipophile vital (DiI et DiO)
et/ou variant fluorescent,
qui se fixe à la surface des membranes cellulaires.
Dans les tissus d’une chimère caille-poulet
un anticorps monoclonal anti-caille
permet de reconnaître les cellules de caille
par immuno-histochimie
et non plus après coloration du noyau
(plus facile).
(Trainor 2005)
DiI (points rouges):
CCNC rh2 vers arc I,
CCNC rh4 vers arc II
Avantages : ne passe pas d’une cellule à l’autre,
se dilue relativement lentement (quand cellule
se divise), approprié pour études à court terme.
(Le Douarin 2004)
Hybridations in situ : Gènes exprimés.
β-Gal
Gènes rapporteurs (« reporters ») :
- enzymes actifs dont produit détecté (lacZ).
Substrat :
Produit :
NB+BCIP
artificiel
incolore
précipité
insoluble
bleu
Marquages fluorescents
Le désavantage
de ces systèmes de marquage cellulaire
est leur durée limitée.
Kulesa 2000
Traçage in vivo (DiI)
(vidéo-microscopie en temps réel
-> comportement migratoire des CCNC.
Utilisation de rétrovirus
Marquages :
-> Tissu osseux
-> Fibres musculaires
Possibilité d’inclure,
puis de faire
des coupes histologiques
(Trainor et Tam 199)5
DiI NCC : tête de flèche
DiO sm III : flèche
Dérivés
du Somitomere IV mésoderme (DiO) : vert
des CNCC (DiI) : rouge.
Evans, Noden (2006)
Double marquage
Injections dans les cellules
de rétrovirus exprimant lac-Z (-> β-galactosidase)
-> carte de territoires présomptifs.
Injection dans cellules individuelles
Utilisation de rétrovirus
La protéine fluorescente verte GFP, « Green Fluorescent Protein »,
est isolée de la méduse Aequorea victoria.
Observations de tissus vivants
C’est une protéine intrinsèquement fluorescente.
La GFP décrite pour la première fois en 1962,
est constituée de 238 Aa.
Le chromophore (AA 65-67)
absorbe en bleu et émet [“fluoresce”] en vert.
Rétrovirus non réplicatifs exprimant GFP.
Souris,
poulet,
grenouille.
Intégration au génome des cellules infectées de l’hôte
In vitro, rabouter sa séquence codante
à celle du promoteur de son choix,
construit un gène recombinant exprimant la GFP.
p-Myo
Séquence codante GFP
p-Shh
Séquence codante GFP
(Royal Swedish Academy of Sciences)
Injecter ce recombinant
dans des cellules ou des embryons
permet
de suivre la migration des cellules transformées,
et d’étudier in vivo le patron d’expression
du gène correspondant au promoteur choisi.
Prix Nobel de chimie (2008)
à O. Shimomura,
M. Chalfie,R. Tsi.
Kulesa 2005
Traçage in vivo (vidéo-microscopie en temps réel
-> comportement migratoire des cellules.
Marquage génétique de lignage cellulaire
- Promoteur ubiquitaire :
toutes les cellules
contenant le gène recombinant
seront fluorescentes.
Apports
de
l’embryologie
descriptive et expérimentale
La GFP permet d'observer
l'animal transgène vivant,
donc de visualiser
des évènements très dynamiques,
comme la migration des cellules.
hairy : rouge
Krüppel : vert
giant : bleu
- Promoteur tissu-spécifique :
L'expression de la GFP est induite
- à un un moment
- ou /et dans un tissu particulier.
Muscles : vert
Neurones : rouge
[B. Gaertner, Stowers Inst.]
Marquage nucléaire
Thymidine 3H incorporée dans l’ADN
Techniques classiques d’ablation
1) Enlever une portion fine de crête neurale d’un animal expérimental,
2) Laisser se développer
3) Observer les lésions
Noden 1975
Autoradiographie des coupes histologiques
-> carte de migration des CCNC du poulet
Problèmes :
- Régénération chez certains animaux :
Rat ( Stemple et Anderson 1992)
- Difficile de délimiter la section -> difficiles comparaisons
- l’absence de développement d’une structure peut résulter
de l’absence des cellules enlevées
ou aussi
de l’ablation de cellules voisines
secrétant des substances trophiques.
Greffes
Chimères caille - poulet
Techniques de greffes
Greffes
N. Le Douarin (1969).
Premières greffes inter-espèces : Wagner 1949 et Andres 1949 .
Les plis neuronaux d’une grenouille sont greffés à un triton.
Comme les os se forment avant la métamorphose chez la grenouille
(contrairement au triton), et que ces os n’ont pas la même morphologie,
il est possible de suivre la différenciation des cellules du greffon.
La caille et le poulet sont des espèces relativement proches au niveau taxonomique,
(tous deux des gallinacés).
Les tissus embryonnaires de caille
greffés dans l'embryon de poulet s'intègrent parfaitement,
et participent à la formation
des organes et tissus de l'hôte.
Montre que les cellules du donneur sont inclues dans les os du receveur.
Les chimères se développent correctement,
arrivent à éclore
et sont souvent viables.
Greffes des CCNC :
-> carte des territoires présomptifs des cellules de l’ectomésenchyme
Greffes du mésoderme paraxial cranial et des 6 somites rostrales
en 1992 -> contribution de chaque type au développement du céphalique.
Chimères caille - poulet
Greffes
Donneur
(poulet)
Marquage nucléaire naturel
Observations de tissus fixés
N. Le Douarin.
observations de C. Le Lièvre (1978)
Hôte
(caille)
Donneur
(caille)
Hôte
(canard)
Zone 1
G1
Zone 2
Zone 3
L’hétérochromatine
des cellules interphasiques
de la caille japonaise
est condensée
en une masse
centro-nucléaire
associée au nucléole.
Zone 4
G2
Zone 5
(Noden 1975)
isochronique
Greffe isochronique :
le donneur et l’hôte sont au même stade de développement embryonnaire.
L'hétérochromatine
des cellules de poulet
est diffuse.
(Le Douarin 2004)
Coloration Feulgen-Rossenbeck
Greffe homotopique (G2 -> zone 4):
Le greffon est inséré au même site que l’endroit d’où il a été prélevé.
Greffe hétérotopique (G1 ->zone 4):
Le greffon est inséré dans un autre site que celui d’où il a été prélevé.
Greffes
3
Orthotopiques
Hétérospécifiques
Isotopiques
Isochroniques.
4
Orientations
antero-postérieur
et
dorso-ventral
respectées,
ou inversées.
2
1
Greffes
Plasticité des informations /
Détermination des CCNC
caille
6
5
-> contribution des CCNC au squelette craniofacial
canard
(Transplantation de CCNC
n’exprimant pas Hox).- Arc I-
B
C
« canille »
« caillard »
->les CCNC du greffon
gardent l’expression de leurs gènes spécifiques;
Mais : effet de taille du greffon.
(Le Lièvre 1978)
hétérochronique
-> Les CCNC de fb, mb, r1 et r2
sont déterminées (gardent la mémoire )
à la formation d’un bec
qui est caractéristique de l’espèce.
(Noden 1986, Tapadia et al., 2005).
Greffes
Chimère poulet / souris
1
23
4 5
Donneur
(caille)
(Mitsiadis 2003)
Hôte
(poulet)
(Couly 1992)
… et les poules ont eu des dents !
-> Carte des territoires présomptifs
des cellules du mésoderme céphalique
paraxial et préchordal.
(montre perte de l’expression de BMP4 dans l’ectoderme du poulet)
Ajouts localisés
de substances agonistes /antagonistes diffusibles.
Modèle amphibiens
LRD : lysinated rhodamine dextran
injecté dans cellules individuelles
Les dextrans, polysaccharides hydrophiles,
synthétisés par Leuconostoc (fermentation de
choucroute) : PM élevé, bonne solubilité,
immunologiquement relativement inertes,
sont des traceurs de cellules vivantes.
L’ajout de lysine au dextran fluorescent
permet de fixer le dextran marqué.
épiblaste
hypoblaste
Dormann Weijer 2006
Implantation de billes imprégnées de FGF.
-> FGF4 stimule
-> FGF8 stoppe
la migration des cellules.
Gross 2006
Yang 2002
Ajouts localisés
de susbtances agonistes /antagonistes diffusibles.
En utilisant de manière systématique les chimères caille/poulet
il a été possible de déterminer avec exactitude
l'origine embryonnaire de tous les dérivés de la crête neurale.
Différenciation du palais
Ces connaissances permettent de mieux comprendre
comment l'embryon des vertébrés se développe.
BMP4
Msx1
Elles permettent donc d'envisager l'étude
des facteurs impliqués dans la différenciation des cellules de la crête .
Implantation d’une bille BMP2
Différenciation
d’un os palatin ectopique
P. Francis-West (1998)
Expression ectopique
de
BMP4 e Msx1 (flèches)
Cette recherche a également permis de comprendre
pourquoi certains syndromes humains sont caractérisés
par des atteintes dans des organes très divers,
mais dont les progéniteurs de crête neurale ont une origine commune.
MAIS :
Selon le type de marquages, ou le modèle expérimental,
les résultats ne sont pas rigoureusement les mêmes
- sur l’origine de certains os.
(-> attention aux extrapolations
à partir de poulet vers souris et homme !
Conclusion :
Chimères caille-poulet
Apports
de
l’embryologie
descriptive et expérimentale
Récemment,
des expériences de co-marquages
ont montré que chez la tortue, les CCCN troncales
ont la capacité de former des os dermiques.
(Gilbert 2007).
Carte des territoires présomptifs du massif céphalique
chez plusieurs modèles expérimentaux
Contribution de différentes populations de cellules
au développement craniofacial.
retrovirus
Problèmes :
Les résections et insertions peuvent léser les tissus environnants.
La taille et le contenu des greffons sont difficiles à contrôler.
Les informations sont obtenues sur une population de cellules.
Noden Trainor 2005