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ECOLE DOCTORALE/PHD PROGRAM
CANCEROLOGY/ONCOLOGY
SUJET DE THESE N° 57
ANNEE UNIVERSITAIRE 2014-2015
TITRE DU PROJET DE RECHERCHE
Etude de la chromatine des séquences satellites par le système Cas9m-PUB.
Studies of the satellite chromatin by Cas9m-PUB system.
L’EQUIPE D’ACCUEIL DES DOCTORANTS
Nom du directeur ou de la directrice de thèse (HDR requise) :
Dr. Iryna PIROZHKOVA et Dr. Vasily OGRYZKO
L’Equipe d’Accueil des Doctorants
(Intitulé du Laboratoire, adresse postale, e-mail, téléphone)
CNRS, UMR8126 - Proteomics and epigenetics’s group
Institute Gustave-Roussy - 114, rue Edouard Vaillant - 94805 VILLEJUIF Cedex
E-mail : [email protected] / [email protected]
Tél. : +33 1 42 11 63 48 / +33 1 42 11 65 25
Nom du directeur ou de la directrice du Laboratoire :
Dr. Joëlle WIELS
NOMBRE DE DOCTORANTS ACTUELLEMENT DANS L’EQUIPE D’ACCUEIL DES DOCTORANTS
(nom, prénom et année d’inscription en thèse)
Anamarija JURISIC (directeur de thèse est V. OGRYZKO), 1
ère
année 2013
Ecole Doctorale de Cancérologie, Biologie, Médecine et Santé 418
DESCRIPTION DU PROJET DE RECHERCHE (Anglais)
The group of Dr. Vasily Ogryzko has developed recently an approach termed PUB-NChIP (Proximity
Utilizing Biotinylation with Native ChIP) to purify and study protein composition of chromatin in the proximity
to a nuclear protein of interest (1,2). It is based on coexpression of a) a nuclear protein of interest, fused
with the bacterial biotin ligase, BirA together with b) a histone fused to BAP, biotin acceptor peptide. Using
Rad18 protein as a model, they demonstrated that chromatin is specifically biotinylated by BirA fusion in the
proximity of the protein of interest. Furthermore, the biotinylated chromatin can be purified on streptavidinagarose beads and its protein and DNA composition can be studied. The limitation of this approach is that
only the sequences associated with a given protein can be purified and analysed.
The current project will be focused on further development of the PUB-NChIP approach that would allow us
to biotinylate (and then purify and study) chromatin associated with ANY chosen genomic sequence. For
this purpose, we will fuse BirA ligase with a catalytically inactive mutant of Cas9 (CRISPR-associated
endonuclease) protein (3), which can be targeted to a given sequence using special guide RNA.
The CRISPR system can be used as a modular and flexible DNA-binding platform for the recruitment of
proteins to a target DNA sequence. We expect that the system will work most efficiently with tandem
repeats, because of the high signal to noise ratio. Therefore, tandem repeats model will be the best
experimental model to develop this new approach. In addition, as the signal (BirA) will be highly increased,
the biotinylated chromatin can be directly visualized by microscopy.
The specific satellite DNA, macrosatellite (D4Z4) and β-satellite repeat (BSR) sequences are essential for
the development of Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD) and it could be considered as potential targets
for the gene therapy in FSHD treatment. Recently, we have shown the functional activity of BSR repeats
that play a role of cis-acting element in the locus related to the FSHD disease (4). Accordingly, we will use
Cas9m-PUB system to biotinylate the chromatin associated with BSR repeats in the cells from FSHD
patients. This will allow us to purify the BSR-associated chromatin and study its properties (such as posttranslational histone modifications, DNA methylation, identification of sequences juxtaposed with BSR
sequences from other genome location).
Repetitive DNA elements are frequently hypomethylated in cancer. The hypomethylation of alpha satellite
repeats (ASR) have been shown in Wilms tumor, ovarian and breast cancer. Recently, a 21-fold increase of
the satellite DNA transcripts has been demonstrated in pancreatic tumours. Similar data have been
obtained for other types of cancer (5). Therefore, Cas9m-PUB approach could be an innovative system for
the study of the satellite DNA containing chromatin in cancer research.
Références :
1. Kulyyassov A, Shoaib M, Pichugin A, Kannouche P, Ramanculov E, Lipinski M, Ogryzko V. PUB-MS: A Mass Spectrometry-based Method to Monitor Protein-Protein Proximity in vivo. (J
Proteome Res. 2011 Oct 7;10(10):4416-2)
2. Shoaib M, Kulyyassov A, Robin C, Winczura K, Tarlykov P, Despas E, Kannouche P, Ramanculov E, Lipinski M, VasilyOgryzko V. PUB-NChIP – “in vivo biotinylation” approach to study
chromatin in proximity to a protein of interest. (Genome Research, 2013 Feb;23(2):331-40)
3. Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, et al. (2013) CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell 154: 442-451.
4. E. Kim°, J. Rich, P. Tarlykov°, A. Karoutas, E. Cochet, D. Malysheva, K. Mamchaoui, V. Ogryzko and I. Pirozhkova. ZNF555 Protein Binds to the Transcriptional Activator Site of the 4qA Allele
and ANT1: Potential Implication in FSHD Disease. // NAR. – in rev.
5. Ting DT, Lipson D, Paul S, Brannigan BW, Akhavanfard S, et al. (2011) Aberrant overexpression of satellite repeats in pancreatic and other epithelial cancers. Science 331: 593–596.
Ecole Doctorale de Cancérologie, Biologie, Médecine et Santé 418
L’équipe du Dr. Vasily Ogryzko a récemment développé une nouvelle technique, nommée PUB-NChIP (Proximity
Utilizing Biotinylation with Native ChIP), pour purifier et étudier les protéines de la chromatine situées à proximité d’une
protéine nucléaire d’intérêt (1,2). Cette approche repose sur la coexpression a) d’une protéine nucléaire d’intérêt, fusionnée
avec la biotine-ligase bactérienne, BirA, et b) d’un histone, fusionné avec un peptide accepteur de biotine, BAP. En utilisant
la protéine Rad18 comme modèle, l’équipe a démontré que, de manière très spécifique, la chromatine à proximité de la
protéine d’intérêt est biotinylée par BirA. De plus, la chromatine biotinylée peut être purifiée à l’aide de billes d’agarose
couplées à la streptavidine afin d’étudier le complexe protéique et d’ADN. Cependant, dans cette approche seules les
séquences associées à une protéine donnée peuvent être purifiées et analysées.
Le projet actuel sera focalisé sur un développement de la technique PUB-NChIP qui nous permettra de biotinyler
(puis de purifier et d’étudier) la chromatine associée à n’importe quelle séquence génomique. Dans ce but, nous allons
fusionner la ligase BirA avec la protéine Cas9 (CRISPR-associated endonuclease) (3) mutée sur son site catalytique, qui
peut cibler une séquence grâce à un ARN guide spécifique.
Le système CRISPR peut être utilisé comme une plateforme modulable et flexible de liaison à l'ADN. Les protéines
de ce système sont alors recrutées afin de cibler une séquence d'ADN spécifique. Nous nous attendons à ce que ce
système fonctionne plus particulièrement avec les séquences répétées en tandem, qui présenteront un signal élevé par
rapport au bruit de fond. Par conséquent, les séquences répétées en tandem seront le meilleur modèle expérimental pour
développer cette nouvelle approche. De plus, comme le signal (BirA) sera augmenté, la chromatine biotinylée pourra être
directement visualisée par microscopie.
Les sequences satellites, les répétitions macrosatellites (D4Z4) et les répétitions β-satellites (BSR), sont essentiels
pour le développement de la dystrophie facio-scapulo-humérale (FSH) et peuvent être considérés comme des cibles
thérapeutiques potentielles. Récemment, nous avons montré que les répétitions BSR possèdent une activité fonctionnelle,
qui joue le rôle d’élément cis-régulateur du locus associé à la dystrophie FSH (4). Par conséquent, nous allons utiliser le
système Cas9m-PUB pour biotinyler la chromatine associée aux répétitions BSR dans les cellules de patients FSH. Ceci
nous permettra de purifier la chromatine associée aux BSR et d’en étudier ses propriétés (modification de l’activité posttraductionnelle des histones, méthylation de l’ADN, identification de séquences juxtaposées avec la séquence BSR qui sont
spatialement éloignées dans le genome).
L’ADN répété est souvent hypométhylé dans les cancers. L’hypométhylation des répétitions α-satellite (ASR) a été
observé dans les tumeurs de Wilms et les cancers de l’ovaire et du sein. Récemment, il a été découvert que les transcrits
d’ADN satellite sont 21 fois plus abondants dans des tumeurs pancréatiques que dans du tissu sain (5). Des résultats
similaires ont été obtenus pour les cancers de l’ovaire, des poumons et du sein. De ce fait, Cas9m-PUB sera un système
innovant pour l’étude de la chromatine de l’ADN satellite dans la recherche contre le cancer.
Références :
1. Kulyyassov A, Shoaib M, Pichugin A, Kannouche P, Ramanculov E, Lipinski M, Ogryzko V. PUB-MS: A Mass Spectrometry-based Method to Monitor Protein-Protein Proximity in vivo. (J
Proteome Res. 2011 Oct 7;10(10):4416-2)
2. Shoaib M, Kulyyassov A, Robin C, Winczura K, Tarlykov P, Despas E, Kannouche P, Ramanculov E, Lipinski M, VasilyOgryzko V. PUB-NChIP – “in vivo biotinylation” approach to study
chromatin in proximity to a protein of interest. (Genome Research, 2013 Feb;23(2):331-40)
3. Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, et al. (2013) CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell 154: 442-451.
4. E. Kim°, J. Rich, P. Tarlykov°, A. Karoutas, E. Cochet, D. Malysheva, K. Mamchaoui, V. Ogryzko and I. Pirozhkova. ZNF555 Protein Binds to the Transcriptional Activator Site of the 4qA Allele
and ANT1: Potential Implication in FSHD Disease. // NAR. – in rev.
5. Ting DT, Lipson D, Paul S, Brannigan BW, Akhavanfard S, et al. (2011) Aberrant overexpression of satellite repeats in pancreatic and other epithelial cancers. Science 331: 593–596.
Ecole Doctorale de Cancérologie, Biologie, Médecine et Santé 418