Transcript Nombre de molécules retrouvées

Application de l’analyse métabolomique de contaminants organiques
dans l’environnement par spectrométrie de masse haute résolution
Jérôme
1,2
Cotton ,
Fanny
1
Leroux ,
Simon
1
Broudin ,
1
Corman ,
Bruno
Christophe
2
Junot ,
Céline
1
Ducruix
1 Profilomic,
Cette recherche a été en partie financée par le
programme
d’Innovation
Stratégique
Industrielle et Oséo/Bpi Agrifood GPS
CEA centre d’étude de Saclay, F-91191 Gif-sur-Yvette
2 Commissariat à l’Energie Atomique, DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM, F-91191 Gif-sur-Yvette.
Contexte : La pollution, une dégradation de notre écosystème environnemental
L’état actuel de pollution des eaux environnementales par les rejets industriels, les produits phytosanitaires et les médicaments est une
réelle préoccupation de santé publique. Traditionnellement, les analyses réglementaires sont réalisées sur des spectromètres de masse de
type triple quadripôles en mode MRM (Multiple Reaction Monitoring). Bien que ces appareils soient sensibles, spécifiques et quantitatifs,
le nombre de molécules détectées en une seule analyse est rarement supérieure à 200. Ces analyses sont restreintes à une liste préétablie
de molécules cibles et par ailleurs ne se préoccupent peu ou pas des résidus médicamenteux ou de métabolites. Les approches
métabolomiques, avec l’aide de la spectrométrie de masse à ultra-haute résolution pourraient permettre une analyse exhaustive des
polluants.
NL: 2.36E5
3acorga i sobares_neg_2#1-31 RT :
0.02-0.98 AV: 31 T : FT MS - p ESI
Ful l ms [ 50.00-250.00]
173.08216
100
50
173.00947
0
100
NL: 2.36E5
2.76E5
NL:
3AcOrgai sobares_neg_2#1-31
i sobares_NEG_1#2-54RTRT
3acorga
: :
0.02-0.99 AV:
AV: 31
53 TT:: FT
FTMS
MS --pp ESI
ESI
0.02-0.98
Fulll ms
ms[[ 50.00-250.00]
50.00-250.00]
Ful
173.08212
173.08216
50
173.00947
173.00947
0
100
NL: 2.76E5
3.07E5
NL:
3acorga i sobares_neg_3#1-83
3AcOrga
sobares_NEG_1#2-54 RT
RT: :
0.01-0.99 AV:
AV: 53
83 TT:: FT
FTMS
MS --pp ESI
ESI
0.02-0.99
Fulll ms
ms[[ 50.00-250.00]
50.00-250.00]
Ful
173.08212
173.08212
50
173.00946
173.00947
Objectif : Utiliser la métabolomique par spectrométrie de masse haute résolution pour la réalisation d’une empreinte globale
0
100
NL:
NL: 3.07E5
3.30E5
3acorga
: :
3acorga iisobares_neg_3#1-83
sobares_neg_4#1-116RT
RT
RT: 0.00 - 29.95
0.01-0.99
T
:
FT
MS
p
ESI
0.00-1.00 AV:
AV: 83
116
T
:
FT
MS
p
ESI
100
Ful
Fulll ms
ms[[ 50.00-250.00]
50.00-250.00]
95
173.08212
173.08213
• Haute résolution = richesse d’informations
50
50
0
100
90
85
Recherche ciblée large spectre
80
173.08213
173.08214
R = 30000
173.00946
173.00943
R = 400
173.00946
50
45
20
15.18
10.66
12.63
6.04 7.20 8.19
13.06
28.30
16.51
5.17
172.8
172.9
173.0
173.1
m /z
173.16667
173.2
10
173.3
50
Analyse globale : recherche de signaux suspects
10.49
15
4.83
3.84 4.65
1.24
2.62
NL: 8.38E3
5
3acorga i sobares_neg_6#2-139 RT :
0
0.01-1.00 AV: 1380 T : IT
MS
- p6 ESI8
2
4
Ful l ms [ 50.00-1000.00]
Plusieurs fouilles de
données successives
Recherche de molécules inconnues ou inattendues
55
NL:
NL: 3.33E5
8.38E3
40
3acorga
RT
3acorga iisobares_neg_5#2-143
sobares_neg_6#2-139
RT::
0.88
35
0.01-1.00
TT:: FT
0.01-1.00 AV:
AV: 142
138
IT
MS
p
ESI
30
Ful
9.01
Fulll ms
ms[[ 50.00-250.00]
50.00-1000.00]
25
173.08214 173.16667
50
0
100
NL:
1.34E10
TIC MS
20131018_po
ol_803_mlc_H
SS-T3_pH25_100ngmL_p
os_045
NL:
NL: 3.30E5
3.33E5
75
3acorga
RT
3acorga iisobares_neg_4#1-116
sobares_neg_5#2-143
RT::
70
0.00-1.00
T
:
FT
MS
p
ESI
0.01-1.00 AV:
AV: 116
142
T
:
FT
MS
p
ESI
65
Ful
Fulll ms
ms[[ 50.00-250.00]
50.00-250.00]
60
Relative Abundance
0
100
173.00943
173.00946
28.38
16.94 18.31
10
12
14
16
Time (min)
18
22.14 22.31
21.16
20
22
22.62
24
26.82 27.23
26
28
0
173.3
5.
Achat des standards
 820 molécules sélectionnées parmi les plus préoccupantes :
pesticides, médicaments, perturbateurs endocriniens
D:\439010\...\ara 0uM CdCl2 n1.1
D:\439010\...\ara 0uM CdCl2 n1.1
90
70
60
40
4.
0
RT: 0,00 - 150,02
100
80
50
40
20
12/07/02 15:50:20
90
60
30
0
Sélection de la colonne chromatographique
 4 colonnes testées : Waters BEH C18, HSS T3 et HSS PFP et Thermo
Hypersil Gold C18
 Optimisation des conditions de pH des solvants
D:\439010\...\ara 0uM CdCl2 n1.1
70
20
10
70
90
60
80
50
70
40
40
30
0
0
20
20
10
60 60
80
Time (min)
120
140
50
40
40
60
30
0
100
80
Time (min)
100
120
20
40
60
80
Time (min)
100
120
140
0
20
40
60
80
Time (min)
100
120
10
Ion principal
140
20
0
Annotation
Traitement du signal
12/07/02 15:50:20
RT: 0,00 - 150,02
100
80
50
10
3.
D:\439010\...\ara 0uM CdCl2 n1.1
90
20
Réalisation d’une banque de données spectrales MS et MSMS
(technologie Orbitrap™)
 Passage individuel des molécules solubilisées en FIA-HRMS
 Recensement des ions principaux : adduits et fragments en source
NL:
1,63E7
Base Peak F: + c
ESI Full ms [
100,00-1000,00]
MS ara 0uM NL:
CdCl2 n1.1 1,63E7
Base Peak F: + c
ESI Full ms [
100,00-1000,00]
MS ara 0uM NL:
CdCl2 n1.1 1,63E7
Base Peak F: + c
ESI Full ms [
100,00-1000,00]
NL:
MS ara 0uM
1,63E7
CdCl2 n1.1
Base Peak F: + c
ESI Full ms [
100,00-1000,00]
MS ara 0uM
CdCl2 n1.1
12/07/02 15:50:20
RT: 0,00 - 150,02
100
80
Echantillons
12/07/02 15:50:20
RT: 0,00 - 150,02
100
30
2.
Peaktable
10 réplicats analytiques
Relative Abundance
1.
Retraitement des données : exemple d’annotation automatique confirmée pour 2 molécules
XCMS
0
140
Confirmation
Echantillons
Molécule 1
Adduits
Fragments
Molécule 2
Massif isotopique
Critères de sélection :
 Nombre de molécules
retrouvées
20131018_pool_803_mlc_HSS-T3_pH2-5_100ngmL_pos_045 #2153 RT: 11.70 AV: 1 NL: 2.10E8
T: FTMS + p ESI Full ms [72.00-1080.00]
216.10011
100
 Répétabilité
Sélection d’une cartouche de pré-concentration en ligne
 Utilisation de la cartouche Oasis HLB (seule disponible sur le
marché en haute pression >1000 bars)
Echantillons
Variables
(Tr-m/z)
Démarche : Développement de l ’analyse ciblée
95
90
85
80
75
70
65
 Sensibilité
Relative Abundance
173.2
Variables
(Tr-m/z)
173.1
m /z
Relative Abundance
173.0
Relative Abundance
172.9
Relative Abundance
172.8
60
55
50
45
40
35
218.09709
30
25
20
15
217.10339
10
5
215.98376
0
215.5
216.0
216.92232
216.18475
216.60062
217.18922
216.5
217.0
217.5
217.99706
218.18288
218.0
m/z
218.5
219.10030
218.97365
219.0
220.10275
219.5
220.0
220.5
Développement d’une méthode permettant l ’analyse de 560 molécules en 36 minutes sur 5mL d’eau
Atrazine
Herbicide
(interdit depuis 2003)
Résultats : exemple d’une analyse réalisée sur 30 eaux du robinet de la région parisienne
 Lieu de prélèvement
 Nombre de pesticides retrouvés
 Nombre de molécules retrouvées
Atrazine-desethyl
Atrazine
Atrazine-2-hydroxy
Hexazinone
Propazine
Oxadixyl
Simazine
Terbuthylazine
Terbuthylazin-desethyl
Tebuthiuron
Metolachlor
Metalaxyl
Metazachlor
Pontault-Combault
Saint-Denis
Chatillon
Boulogne
Romainville
Fontenay-ss-bois
Creil
Massy
Palaiseau
Paris-16eme
Sceaux
Paris-17eme
médicaments
Igny
Gentilly
pesticides
Paris-14me
Valsartan
Hypertenseur
(Insuffisance cardiaque)
Carbamazepine
Antiépileptique
0
5
10
15
20
Valsartan
Poissy
Verapamil
Lieusaint
Carbamazepine
Saclay
10-11-Epoxycarbamazepine
Gif-sur-Yvette
Clotrimazole
Sainte-Genevive-des-Bois
Ketoprofen
Viarmes
Forges-les-bains
Zolpidem
Le-Vesinet
Quetiapine
0
5
10
15
20
25
Zolpidem
Sédatif - Hypnotique
 Toutes détectées en dessous des limites
réglementaires (0.1µg/L/molécule)
 Interrogation quant à l’effet cocktail
 Présence de métabolites
 Présence de molécules interdites depuis
10 ans
Spiramycin
Versailles
25
 Nombre de médicaments retrouvés
Paris-15me
Maurepas
Metolachlor
Herbicide
(interdit depuis 2003)
0
5
10
15
Conclusion - Perspectives
Le développement d’une méthode d’analyse de l’eau basée sur les approches métabolomiques permet la détection simultanée de 560 molécules (308 médicaments et 252 pesticides) en une seule
acquisition sur un échantillon de 5 mL. Les premiers résultats acquis sur 30 eaux du robinet de la région parisienne montrent une pollution moyenne de 15 molécules par échantillon dont 20% de
résidus de médicaments et 80% de pesticides. Cette méthode est en cours de validation en vue d’une accréditation pour un nombre total qui devrait atteindre 800 molécules cibles. En parallèle,
l’analyse sans a priori des spectres de masse en ultra-haute résolution devrait permettre la détection de contaminations non suspectées ou accidentelles.