第一項 「大腸菌を用いた形質転換」“DNAは遺伝子の本体”

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Transcript 第一項 「大腸菌を用いた形質転換」“DNAは遺伝子の本体”

生命科学教育デジタルコンテンツ
「遺伝子操作を基本から学ぼう
-実験に関する小問に挑戦してみよう!- 」
第一項
「大腸菌を用いた形質転換」“DNAは遺伝子の本体”
コンテンツシナリオ
2007.03.21
■生命科学教育デジタルコンテンツ
第一項 「大腸菌を用いた形質転換」“DNAは遺伝子の本体”
講座タイトル
第
1章
1
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
1
章タイトル
原稿(シナリオ)
生命科学の世界にようこそ!生命科学関連
の新しい技術を総称して
バイオテクノロジーと呼んでいますが、その
中でも重要な技術として、
DNAの切断・再結合を行う遺伝子組換えな
どの遺伝子操作(遺伝子工学)があります。
ある生物から取り出したDNAを他の生物の
DNAに組み込む遺伝子組換えも可能となっ
ています。もちろん、このような遺伝子組換
え実験は、法律に基づき、安全に実施され
ています。
備
考
節
画
面
動
き
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
2
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
遺伝子組換え(遺伝子操作)によって、有用
なタンパク質の設計図である遺伝子などを
含む目的DNA断片を
他の生物の細胞
染色体DNA
イラスト:
立体的に描いてください。
イラスト:
プラスミドの色をうす緑に変更。
これ以降のシーンも全てです。
他の生物の細胞
染色体DNA
インスリン
を作る
遺伝子部分
他の生物の細胞
備
考
染色体DNA
き
講座タイトル
第
1章
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節
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1
項
シーン
項タイトル
2
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
他の生物の細胞
染色体DNA
他の生物の細胞
染色体DNA
他の生物の細胞
染色体DNA
他の生物の細胞
染色体DNA
細胞の外から入れて、
この細胞内でその有用なタンパク質や目的
DNA断片自身を大量合成することができま
す。
(第2項⑨の内容に関する伏線的なアニメを
入れるが、深入りはしない)
備
考
き
講座タイトル
第
1章
1
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
2
章タイトル
原稿(シナリオ)
このとき、目的DNAを増やすために用いら
れるDNAをベクターDNA(vector:運び屋分
子)、
備
考
節
画
面
動
他の生物の細胞
染色体DNA
他の生物の細胞
染色体DNA
き
講座タイトル
第
1章
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節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
2
章タイトル
原稿(シナリオ)
このベクターDNAにつなぎ込まれる目的D
NAをインサートDNA、
これらのDNAを増やすための細胞を宿主
(host)と呼びます。
画
面
動
他の生物の細胞
他の生物の細胞
染色体DNA
遺伝子組換え実験でよく行われる大腸菌形
質転換では、
大腸菌の染色体DNA
ベクターDNAとしてプラスミド(plasmid)DN
A、
備
考
大腸菌の染色体DNA
き
講座タイトル
第
1章
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
2
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原稿(シナリオ)
宿主として大腸菌が用いられます。
備
考
1
画
面
動
大腸菌の染色体DNA
き
講座タイトル
第
1章
1
このコンテンツでは、まず、遺伝子操作を行
う上で最も基本となる「大腸菌を用いた形質
転換」について学ぶことにしましょう。
皆さんは「形質転換」という言葉を聞いたこ
とがありますか?
「形質」というのは生物の持っている様々な
性質のことです。
備
考
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
3
章タイトル
原稿(シナリオ)
色や大きさや形、
節
画
面
動
き
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項
シーン
項タイトル
3
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
暑さに強いか寒さに強いか、
行動パターン、そして、どんな栄養が必要か
といったことまで全て「形質」です。
形質転換とは、一般に、ある種の微生物に、
細胞外からDNA(遺伝子)を入れて、
イラスト:
最初は細胞の色は薄黄色です。
その微生物の遺伝的形質を変化させること
を言います。この技術は、現在行われてい
る遺伝子工学上の最重要技術の一つです。
しかし、この技術は、生命科学にとって最も
重要な真実を明らかにした歴史的実験に基
づいていることを忘れてはなりません。
備
考
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面
動
き
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項
シーン
項タイトル
3
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原稿(シナリオ)
画
面
動
その実験とは、「DNAが遺伝子の本体であ
る」ということを最初に明らかにした「肺炎双
球菌の実験」です。
この実験では、本来、動物にとっては無毒な
R型肺炎双球菌に、
※矢印は動きの指示
なので実際は表示さ
せません
備
考
き
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1章
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節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
3
章タイトル
原稿(シナリオ)
外部から、有毒なS型肺炎双球菌のDNAだ
けを入ることによって、
備
考
節
画
面
動
き
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節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
3
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原稿(シナリオ)
画
面
動
き
もともと無毒だったR型菌が、動物への毒性
という新たな遺伝的形質を獲得しました。
正常な2匹のねず
みに菌がそれぞ
れ入っていき、S
型菌のねずみだ
けが病気で寝る。
※矢印は動きの
指示なので実際
は表示させませ
ん
この結果から、 「DNAが遺伝子の本体であ
るということ」が証明されたのです。
しかし、この形質転換実験に用いられた肺
炎双球菌は、危険性が高く遺伝子操作など
には適しません。
そこで、現在では無毒で安全なK12株という
種類の大腸菌が用いられています。
備
考
講座タイトル
第
1章
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節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
4
章タイトル
原稿(シナリオ)
まず、遺伝子操作の基本:大腸菌形質転換
において、細胞外から入れるベクターDNA
として用いられる
画
面
動
大腸菌の染色体DNA
大腸菌の染色体DNA
プラスミドDNAについてご説明しましょう。
大腸菌の染色体DNA
プラスミドDNAとは、細胞内で複製され、世
代を通じて安定して娘細胞に受け継がれる
にもかかわらず、染色体DNAとは別個に存
在して自律的に増殖する遺伝因子の総称で
す。一般に染色体DNAに比べ極めて小さい
環状のDNA分子で、原則として細胞の生存
に関しては必要不可欠というわけではあり
ません。
備
考
き
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項
シーン
項タイトル
5
章タイトル
原稿(シナリオ)
画面にあるように、大腸菌の染色体DNAは、
環状のDNAであり、約300万塩基対で、各
細胞当たり1分子しか存在しません。
一方、プラスミドDNAは、数千塩基対の小さ
な環状のDNAで、各細胞当たり200~300分
子存在します。(プラスミドDNA写真入れる)
備
考
節
画
面
動
大腸菌
大腸菌
き
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節
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項
シーン
項タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
遺伝子操作(遺伝子組換え)では、このよ
うなプラスミドDNAにタンパク質の設計図で
ある遺伝子などを含む目的DNA断片(イン
サートDNA)をつなぎ込み、
目的DNA断片
(インサートDNA)
備
考
6
章タイトル
き
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第
1章
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節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
6
章タイトル
原稿(シナリオ)
大腸菌などの宿主を形質転換させます。こ
れにより、形質転換された宿主に有用なタン
パク質やDNAを作らせることが可能となりま
す。
備
考
節
画
面
動
き
講座タイトル
第
1章
1
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
6
章タイトル
原稿(シナリオ)
他の生物由来の目的DNA断片を入れるこ
とも可能なので、このような遺伝子操作はバ
イオテクノロジーの最も基本的かつ重要な
技術ということで世界の生命科学の研究現
場で行われているわけです。
そこで、ここでは、まず、大腸菌を目的DNA
断片を含まない元のプラスミドDNA自体に
よって形質転換して、この大腸菌の遺伝的
形質を変える実験についてご説明しましょう。
備
考
節
画
面
動
き
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節
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1
項
シーン
項タイトル
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原稿(シナリオ)
画
面
動
き
このように、大腸菌の細胞外から、プラスミ
ドDNAが入るのですが、
(1mm=1/1000mm)
どのようにして大腸菌にプラスミドDNAが
入ったことを確認できるのでしょうか。考えて
みてください。
コロ
ニーの
写真
(大腸菌の集まり)
先ほどの続きで
大腸菌小さくな
って、シャーレが
フェードイン。
(シャーレの中
に大腸菌が入っ
ていますよとい
うイメージで。)
コロニーの写真
表示。
ではここで、問題です。一体どのようにして
大腸菌にプラスミドDNAが入ったことを確認
できるのでしょうか。次の①~④から1つ選
んでください。4択:①眼で見て入れるので
確認できる。②プラスミドDNAに色をつけて
あるので確認できる。③大腸菌が細胞分裂
できなくなるので確認できる。④プラスミドD
NAの中に目印になる特有の遺伝子を入れ
てあるので確認できる。
一旦停止→正解:ピンポン 不正解:ブザー
(以下同様)
もちろん、④が正解です。
備
考
講座タイトル
第
1章
1
大腸菌形質転換とは、目印になる特有な遺
伝子が大腸菌の中で働いて、
大腸菌の遺伝的形質を変化させることであ
り、
この実験も「DNAが遺伝子の本体である」と
いうことを証明した実験の1つです。
備
考
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1
項
シーン
項タイトル
7
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原稿(シナリオ)
大腸菌自体が
節
画
面
動
き
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節
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1
項
シーン
項タイトル
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原稿(シナリオ)
約3mmで、約300分の1mm以下の大きさで
あり、DNAの太さは、さらにその約1500分
の1にあたる2nmなので、光学顕微鏡でもD
NAを見ることはできません。よって、①②は
明らかに不可能ですね。
画
面
動
2nm
(1nm=1/1000mm)
形質転換で宿主細胞の大腸菌が分裂でき
なくなったら、生育不能となり、遺伝子操作
しても意味がないので、③も明らかに間違い
です。
備
考
き
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1章
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節タイトル
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項
シーン
項タイトル
8
章タイトル
原稿(シナリオ)
それでは、プラスミドDNAにプログラムされ
ている、この目印遺伝子についてご説明し
ましょう。
一般に、プラスミドDNAには、抗生物質と呼
ばれる薬剤に対する耐性遺伝子が存在しま
す。
抗生物質とは、生物の正常な生育または機
能を阻害する物質ですが、一般には、細菌
などの原核生物の生育を妨げる物質です。
備
考
節
画
面
動
き
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節タイトル
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項
シーン
項タイトル
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原稿(シナリオ)
大腸菌の形質転換にはペニシリンの一種で
あるアンピシリンという物質がよく用いられ
ます。
大腸菌は原核生物ですから、アンピシリン
耐性遺伝子(アンピシリン分解酵素の構造
遺伝子)を外部から取り入れない限り生育で
きません。
備
考
節
画
面
動
き
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節
節タイトル
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項
シーン
項タイトル
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原稿(シナリオ)
画
面
動
き
もし、この遺伝子が大腸菌に入れば、大腸
菌は抗生物質に対する耐性という形質を獲
得し、抗生物質存在下でも生育することが
できるようになります。
プラスミドが
増え、にこ
っと笑って
元気もりも
り。
では、アンピシリン耐性遺伝子を持ったプラ
スミドDNAが入った大腸菌はアンピシリン存
在下でどうなると思いますか。
もうわかりましたね。
イラスト:
バックのきみどりを薄紫に変更。
これ以降のシーンも全てです。
つまり、目印遺伝子であるアンピシリン耐性
遺伝子を持ったプラスミドDNAを細胞の外
から入れると、その大腸菌は、アンピシリン
存在下でも生育可能となるので、プラスミド
DNAが大腸菌に入ったことが確認できるの
です。
備
考
講座タイトル
第
1章
原稿(シナリオ)
1
節
節タイトル
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項
シーン
項タイトル
8
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画
面
動
き
プラスミドが
増え、にこ
っと笑って
元気もりも
り。
大腸菌君
の顔などが
消え、普通
の大腸菌
のイラスト
になる。
大腸菌が
分裂して増
えていく。
※実写ビデ
オの映像を
参考。
備
考
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節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
9
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原稿(シナリオ)
画
面
動
き
これは、遺伝子操作によく用いられるあるプ
ラスミドDNA(pUC119)の遺伝子地図で、
プラスミドが持つ主な遺伝子を示した図です。
先ほど説明したアンピシリン耐性遺伝子は、
Amprと示されています。ori (オリジン) とあ
るのは、プラスミドDNAの複製開始点と呼
ばれる特異的な塩基配列です。
ではここで問題です。プラスミドDNAは、必
ずOri(オリジン)部位を持たなければなりま
せん。それはなぜでしょうか。
(一旦停止)
「解説に進む」
ボタン表示。
解説に進む
その通り、この部位がないと大腸菌内でDN
Aの複製、つまりコピーを作ることができま
せん。プラスミドDNAが大腸菌に入ることが
できても、そのコピーを複製できなければ、
次世代の娘細胞に受け継ぐことができない
ということですね。
備
考
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第
1章
1
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項
シーン
項タイトル
9
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原稿(シナリオ)
また、P・O・lacZとあるのは、「ラクトースオ
ペロン」のコンテンツで学んだ遺伝子群です。
Pとあるのは、プロモーター領域で、
備
考
節
画
面
動
き
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項
シーン
項タイトル
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原稿(シナリオ)
RNA合成酵素に転写を開始させるための
塩基配列、
0は、オペレーター領域で、
RNA合成酵素の転写を制御する塩基配列、
lacZは、b‐ガラクトシダーゼ(乳糖分解酵
素)のアミノ酸配列を指定する構造遺伝子で
す。
備
考
節
画
面
動
き
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項
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原稿(シナリオ)
これらのラクトースオペロンの遺伝子群は、
遺伝子操作によって、目的のDNA断片をつ
なぎ込み遺伝子組換えプラスミドを新たに作
成するための重要な領域です。この話は、
次のコンテンツ「遺伝子組換え実験を具体
例で学ぶ」でお話するとして、大腸菌の形質
転換の話に戻りましょう。
備
考
節
画
面
動
き
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項
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項タイトル
10
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原稿(シナリオ)
画
面
動
き
大腸菌形質転換では、カルシウム法と呼ば
れる方法がよく用いられていますが、この実
験を簡単にご説明しましょう。まず、このよう
に大腸菌を液体培地の中で培養します。
大腸菌液体培養
大腸菌
次に、この培養液を遠心機にかけて大腸菌
を沈殿させ、
遠心機が
回転する。
※矢印は
表示させま
せん。
大腸菌
備
考
※矢印は
表示させま
せん。
講座タイトル
第
1章
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節
1
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項
シーン
項タイトル
10
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原稿(シナリオ)
画
面
動
き
上澄みの培養液を捨てて大腸菌だけを残し
ます。この操作を、集菌といいます。
集菌
大腸菌
次に、集菌した大腸菌の塊に、50mMの塩
化カルシウム溶液(CaCl2)を加え、
大腸菌がバラバラになって塊が眼に見えな
くなるまで十分に攪拌します。この操作を、
懸濁といいます。
備
考
混濁
テキスト表
示。
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
項
シーン
項タイトル
10
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
そして、0℃で5分間放置したあと、
0℃で5分間
この塩化カルシウム懸濁液に、 プラスミドD
NAを加えます。
この混合液をスプレッドという操作で、このよ
うに寒天培地の表面に塗り広げます。
備
考
1
動
き
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
10
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
き
スプレッド
この寒天培地は、37℃で一晩培養します。
これらの一連の操作は、もちろん、他の細菌
などの混入を防ぐために、無菌的に行われ
ることに注意します。特設サイト⇒ここからは、
吉本自作の大腸菌の形質転換簡便法マ
ニュアルビデオにリンクして展開
備
考
黄色っぽい液
が薄く広がっ
ていく。
また視点がだ
んだん動いて
横からの視点
に戻る。
講座タイトル
第
1章
原稿(シナリオ)
備
考
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節
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項
シーン
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10
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画
面
動
き
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1
節
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項
シーン
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11
章タイトル
原稿(シナリオ)
この方法では、大腸菌を塩化カルシウム液
(CaCl2)で処理し、そのあとに、プラスミドD
NAを加えることによって、
このDNA分子が大腸菌に侵入し、菌内で外
部から入った遺伝子が働く(発現する)
ことによって大腸菌の遺伝的形質を変える
ことになります。ここで、不思議なことの気が
つきませんか。形質転換ということは、
画
面
動
き
⑩
大腸菌はう
すい黄色。
DNAが大
腸菌に入り
、
大腸菌が青
色に変化。
大腸菌の外から大きな生体分子であるDN
Aを入れることになるのですが、
備
考
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
なぜ、このような大きなDNA分子が細胞膜
などを通過して大腸菌内に侵入できるのか。
また、このようなことをして、なぜ大腸菌が死
なないのかなど多くの疑問が生じます。これ
らの問題に対する正解はまだ得られていま
せん。
とにかく、塩化カルシウム液(CaCl2)で処理
されることによって、一時的に細胞膜にDN
A分子が通過できるような穴があく可能性が
あり、大腸菌は危機的な状態にあるようです。
よって、塩化カルシウム処理後は、0℃に近
い低温に保存されなければ、形質転換はう
まく行きません。
先生にデータの表をいただ
ける。
備
考
11
章タイトル
動
き
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
12
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
き
カルシウム処理した大腸菌液を
先ほど学んだ抗生物質アンピシリ
ンを含んだ寒天培地にスプレッドし
ます。
すると、プラスミドDNAが侵入し、
形質転換した菌(形質転換体)しか
生育できません。形質転換体はこ
のように増殖し、
大腸菌君が大
腸菌になり、分
裂して増えてい
く。
一晩でコロニーという菌の塊となり
ます。
備
考
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
12
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
き
大腸菌の大きさは、約3mmですが、一晩で
このように数mmのコロニーとなり、肉眼でも
見えるようになるのです。 (実物コロニー写
真)
(1mm=1/1000mm)
ではここで問題です。この1個のコロニーに
ついて調べてみたところ、何と約1千万匹
(細胞)の大腸菌の集まりでした。
この1個のコロニーは、大腸菌液を寒天培
地にスプレッドしたときに、たまたまそこに撒
かれた1匹の大腸菌形質転換体から細胞分
裂してできたものなので、 1個のコロニーの
中に存在する大腸菌は、すべて、全く同じ遺
伝子を持ったクローンです。
では、1匹の大腸菌が約何回分裂して1個
のコロニーになったと思いますか。考えてみ
てください。では次の①~③から1つ選ん
でください。3択:①約20回 ②約2
000回 ③約200000回
一旦停止→正解:ピンポン 不正解:ブザー
①約20回
②約2000回
③約200000回
①
その通り、計算の結果から、一晩でおおよそ
24回ということですから、①約20回が正解
です。
x
y=2
1千万匹=107 匹
10 7 =2x
log10 =log2
x≒23
備
考
①約20回
②約2000回
③約200000回
計算式を表
示。
講座タイトル
第
1章
1
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
12
章タイトル
原稿(シナリオ)
さらに、この結果から大腸菌は、約20分~
30分に1回の速さで細胞分裂することがわ
かりますね。(分裂の実写映像)
備
考
節
画
面
動
き
講座タイトル
第
1章
1
節
1
項
シーン
項タイトル
13
章タイトル
原稿(シナリオ)
このように、プラスミドDNAが、大腸菌の外
から入ることで、
アンピシリン非耐性菌(アンピシリン存在下
で生きることができない菌)が、アンピシリン
耐性という形質を得たわけで、
このことから、「DNAが遺伝子の本体であ
る」ことは明らかということがわかりましたね。
では最後に皆さんが分子レベルでこの大腸
菌形質転換の現象を理解できているかを
問ってみましょう。
備
考
節タイトル
画
面
動
き
プラスミドが
大腸菌君に
入る。
プラスミドが
増え、にこ
っと笑って
元気もりも
り。
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
13、14
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
き
では問題です。この現象、つまり、「なぜ、こ
の形質転換体がアンピシリン存在下で生き
ることができるのか」を分子レベルの遺伝子
発現まで言及して説明してみてください。で
はどうぞ。(一旦停止) できましたか。では、
解説です。
(ここからシーン14)
なぜ、この形質転換体がアンピシリン存在
下で生きることができるのか」を遺伝子発現
のレベルで説明してみましょう。
大腸菌の染
色体DNA
まず、大腸菌内に侵入した
プラスミドのAmpr (アンピシリン耐性遺伝
子)が、
アンピシリン耐
性遺伝子
備
考
ナレ「アンピシ
リン~」で、ア
ンピシリンの部
分が強調され
る。
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
14
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
き
このように大腸菌内で転写され、mRNA(伝
令RNA)が合成されます。
※矢印は表示
させない。
mRNA
次に、このmRNAがリボソームで翻訳され、
アンピシリン分解酵素が合成されます。
昨年のコンテンツで使用した、mRNAが
リボソームに翻訳され、タンパク質ができる
アニメーション。
タンパク質がアンピシリン分解酵素になる。
(実際には○になればオッケー)
この酵素は、このように寒天培地に存在す
るアンピシリンを次々に分解することによっ
て、大腸菌は死滅することなく生育できるよ
うになるわけですね。これが、大腸菌形質転
換の意味であり
備
考
アンピシリンが
あるところに、
大腸菌くんが
スーパーマン
のように飛ん
でくる。
講座タイトル
第
1章
1
節
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
14
章タイトル
原稿(シナリオ)
画
面
動
き
大腸菌くんの
まわりから、だ
んだんアンピ
シリンが引い
ていく。
「DNAが遺伝子の本体である」ということで
す。
備
考
二重らせんの
プラスミドがフ
ェードイン。
講座タイトル
第
1章
1
節タイトル
1
項
シーン
項タイトル
15
章タイトル
原稿(シナリオ)
どうでしたか?目に見えないこのような分子
レベルの生命科学の世界にも、すばらしい
世界が存在するのです。すごいですよね。
あなたの生命に対するイメージは変わりまし
たか?もしよければ、あなたのご意見・ご感
想・ご質問などお聞かせ下さい。
ではまた、生命科学デジタルコンテンツでお
会いしましょう。
備
考
節
画
面
動
き
講座タイトル
第
2章
1
節
OX選択方式
テスト
章タイトル
原稿(シナリオ)
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
問
題
答え
解
説
No.