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ゲノム分子生物学1
2008年4月30日 担当: 中東
Terry Brown
ゲノム
Third Edition
第2章:
DNA研究法
第2章:
DNA研究法
•2.1
DNA操作に用いられる酵素
•ポリメラーゼ
•ヌクレアーゼ
•リガーゼ
•修飾酵素
•2.2
DNAクローニング
•クローニングベクター
•2.3
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
•2.1
ポリメラーゼ
Polymerase
Figure 2.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNA操作に用いられる酵素
ヌクレアーゼ
Nuclease
リガーゼ
Ligase
2.1.1
DNAポリメラーゼ
鋳型依存的DNAポリメラーゼ
Figure 2.4a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
鋳型依存的DNAポリメラーゼ
Figure 2.5 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.6a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.6b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNAの特定領域を合成する
>90℃
プライマーアニーリング<55℃
37℃
Figure 2.28 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
繰り返し合成 (1)
Figure 2.29 (part 1 of 2)
Genomes 3 (© Garland Science 2007)
繰り返し合成 (2)
Figure 2.29 (part 2 of 2)
Genomes 3 (© Garland Science 2007)
•2.3
Figure 2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
•ゲル電気泳動によるPCR産物長の確認
Figure 2.30 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNAポリメラーゼの持つ活性
Figure 2.7 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNAポリメラーゼの持つ活性
Figure 2.7a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNAポリメラーゼの持つ活性
Figure 2.7b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNAポリメラーゼの持つ活性
Figure 2.7c Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNAポリメラーゼI
大腸菌酵素
DNAラベル
Klenow
polymerase
PolIの5’-3’exo活
性を失わせたもの
DNAラベル
シーケナーゼ
T7 DNAポリメラー
ゼの改変
シーケンス
耐熱性ポリメラーゼ
好熱菌
PCR
逆転写酵素
レトロウィルス
cDNA合成
Table 2.1
Tech Note 2.1
ヌクレアーゼ
DNA, RNA, ハイブリッド
Figure 2.4b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Nucleases available from NEB(New England Biolabs)
DNase I (RNase-free)
Exonuclease I (E. coli)
Exonuclease III (E. coli)
Exonuclease T
Lambda Exonuclease
Micrococcal Nuclease
Mung Bean Nuclease
Nuclease BAL-31
RecJf
T7 Exonuclease
Table 2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Restriction Nucleases available from NEB(New England Biolabs)
A
AatII Acc65I AccI AciI AclI AcuI AfeI AflII AflIII AgeI AhdI AleI AluI
AlwI AlwNI ApaI ApaLI ApeKI ApoI
AscI AseI AsiSI AvaI AvaII AvrII
B
BaeGI BaeI BamHI BanI BanII BbsI BbvCI BbvI BccI BceAI BcgI BciVI BclI BfaI BfuAI BfuCI BglI BglII BlpI
Bme1580I BmgBI BmrI BmtI BpmI Bpu10I BpuEI BsaAI BsaBI BsaHI BsaI BsaJI BsaWI BsaXI BseRI BseYI BsgI BsiEI
BsiHKAI BsiWI BslI BsmAI BsmBI BsmFI BsmI BsoBI Bsp1286I BspCNI BspDI BspEI BspHI BspMI BspQI BsrBI BsrDI BsrFI
BsrGI BsrI BssHII BssKI BssSI BstAPI BstBI BstEII BstNI BstUI BstXI BstYI BstZ17I Bsu36I BtgI BtgZI BtsCI BtsI
C
Cac8I ClaI
CspCI
CviAII CviKI-1
CviQI
D
DdeI DpnI
DpnII
DraI DraIII
DrdI
E
EaeI EagI EarI
EciI EcoNI
EcoO109I EcoP15I EcoRI EcoRV
F
FatI FauI
Fnu4HI
FokI FseI
FspI
H
HaeII HaeIII HgaI HhaI HincII
HindIII HinfI HinP1I HpaI HpaII
HphI Hpy166II Hpy188I Hpy188III Hpy99I HpyAV HpyCH4III HpyCH4IV HpyCH4V
K
KasI
KpnI
M
MboI MboII MfeI MluI
MlyI MmeI MnlI
MspA1I MspI MwoI
N
NaeI NarI NciI NcoI
NdeI NgoMIV NheI NheI-HF™
NlaIII NlaIV NmeAIII NotI
P
PacI PaeR7I PciI PflFI PflMI
PhoI PleI PmeI PmlI PpuMI
PshAI PsiI PspGI PspOMI PspXI
R
RsaI
RsrII
S
SacI SacII SalI SalI-HF™ SapI Sau3AI Sau96I
SspI StuI StyD4I StyI SwaI
MscI MseI MslI
SbfI ScaI ScaI-HF™ ScrFI SexAI SfaNI SfcI
T
TaqαI TfiI TliI
TseI Tsp45I
Tsp509I TspMI
TspRI Tth111I
X
XbaI XcmI
XhoI
XmaI
XmnI
Z
ZraI
NruI NsiI NspI
PstI PvuI PvuII PvuII-HF™
SfiI SfoI SgrAI SmaI SmlI SnaBI SpeI SphI SphI-HF™
Restriction Endonuclease (制限酵素)
DNAの特定の配列を認識して切断
Figure 2.9 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
制限酵素
Restriction Enzyme
制限と修飾 (1950s)
A
B
Aタイプの細菌で増殖したファージはBタイプの細菌での
増殖を制限される
制限酵素
Restriction Enzyme
制限と修飾 (1950s)
一旦Bタイプの細菌で増殖したファージは修飾をうけ、Bタイプの細
菌での増殖を制限されなくなる。
制限酵素
Restriction Enzyme = Restriction Endonuclease
GAATTC
5’
GAATTC
5’
EcoRI 制限酵素
G
AATTC
G
AATTC
5’
5’
修飾酵素
Modification Enzyme = Modification Methylase
5’
GAATTC
5’
GAATTC
EcoRI 修飾酵素
認識配列2番目のアデニンをメチル化
5’
*
GAATTC
*
GAATTC
EcoRI 制限酵素
1978ノーベル生理医学賞
5’
細胞に注入されたファージDNA
切断（制限）されて分解
制限を免れ、メチル化修飾を受けてファージとして増殖
いずれかの運命をたどる
制限酵素
DNAを特定の箇所で切断
->特定の断片が出来る
GAATTC
5’
5’
GAATTC
EcoRI 制限酵素
G
G
AATTC
AATTC
G
AATTC
AATTC
G
断片の大きさでDNAを区別する
アガロースゲル電気泳動
Technical Note 2.2 Figure T2.1 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
違う濃度のアガロースで泳動した際の分離の差
Technical Note 2.2 Figure T2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
サザンブロットハイブリダイゼーション
Figure 2.11 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
サザンブロットハイブリダイゼーション（１）
電気泳動後のゲルからナイロン膜にDNAを転写
Figure 2.11a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
サザンブロットハイブリダイゼーション（２）
蛍光や放射性同位体などでラベル
同じ配列を持つDNA断片に結合
Figure 2.11b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
制限酵素の分子生物学への応用
(DNAクローニング)
GAATTC
5’
GAATTC
5’
EcoRI 制限酵素
5’
AATTC
AATTC
5’
G
G
AATTC
5’
AATTC
5’
G
G
5’
5’
どのEcoRI断片もendの
形状は同じ
平滑
粘着
Table 2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.10a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
2.1.3 DNAリガーゼ (DNA ligase)
Figure 2.4c Genomes 3 (© Garland Science 2007)
生体内でのDNAリガーゼの機能はDNA複製、修復で(秋学期)
Figure 2.12a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
平滑末端のライゲーション (T4 DNA ligase)
Figure 2.12b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
粘着末端のライゲーション (T4 DNA ligase, E. coli DNA ligase)
Figure 2.12c Genomes 3 (© Garland Science 2007)
•2.2
Figure 2.2 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
DNAクローニング
大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(1)
Figure 2.15 (part 1 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(2)
Figure 2.15 (part 2 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
大腸菌プラスミドに動物由来DNAをクローニングする(3)
Figure 2.15 (part 3 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
1ng =3x108 分子
108 細胞
〜104 形質転換体
Figure 2.16 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
プラスミドベクターの構造
プラスミドが入った細
胞の選択の為の薬剤
耐性
大腸菌内での自律増
殖に必要なシグナル
外来遺伝子挿入の有
無を示すlacZ’遺伝子
外来遺伝子挿入の為
の制限酵素切断部位
(MCS)
Figure 2.17 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
プラスミドDNAの抽出法 (1)
Technical Note 2.3 Figure T2.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
プラスミドDNAの抽出法 (2)
Technical Note 2.3 Figure T2.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
バクテリオファージベクター
Figure 2.19 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.19 (part 1 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
溶菌サイクル
Figure 2.19 (part 2 of 2) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
溶源化サイクル
λファージゲノムのいらない部分を取り去ってベクターとして使う
Figure 2.20a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
λファージベクター
キャプシドにパッケージできるDNAの長さはある範囲で決まっている
Figure 2.20b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
λファージベクターを使ったクローニング
cos-cosがヘッドにパーケージングされる
Figure 2.21 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
λファージベクターを使ったクローニング
Figure 2.22 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
様々なベクターでヒトゲノムを網羅するのに必要なクローン数
Table 2.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
コスミド (cosmid)ベクター
λファージ粒子にパーッケージされて感染し、
その後はプラスミドとしてふるまう
Figure 2.23 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
人工染色体ベクター
(Yeast Artificial Chromosome, YAC)
Figure 2.24 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.25 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.25a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.25b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
YAC以外のイーストベクター
Figure 2.26a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.26b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
Figure 2.27 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
http://www.biotech-house.jp/glossary/glos_40.html