Transcript Sender - iGEM 2007

物語
バラバラだった大腸菌が・・・
一か所に集まり・・・
Ｖｖ
しだいに大きくなり・・・
有限の大きさで止まります。
私たちのプロジェクトに必要なもの
●大腸菌同士の吸着
→鞭毛にヒスタグを挿入
●大腸菌の一か所への集合
→クオラムセンシング
●大腸菌の集合体の大きさの制御
→AHLクエンチャー
SENDER
tetR
LuxI
tetR
FliC-His
・常にAHLを生産する。
・常にヒスタグ付きの鞭毛を生やす。
RECEIVER
tetR
aiiA
pLux
LuxR
pLux
GFP
FliC-His
・常にaiiAを発現する。
・AHL存在下でGFPを発現する。
・AHL存在下でヒスタグ付きの鞭毛を生やす。
DESIGN
Receiver
Sender
Senderは常にヒスタグ付きの鞭毛が生えているのでニッケルイオンを仲
介して大腸菌同士が吸着します。
Senderは常にAHLを生産します。
DESIGN
Senderが生産したAHLが届く範囲にいるReceiverはGFPを発現し、ヒスタ
グ付きの鞭毛を生やします。
DESIGN
ヒスタグ付きの鞭毛が生えたReceiverはニッケルイオンを仲介として
Senderの周りに吸着します。
DESIGN
ReceiverはaiiAを発現してAHLを分解します。
AHLが届く範囲が狭まり、鞭毛が生えるReceiverが制限され大腸菌の集
合体の大きさが制限されます。
Flagellin,FliC
Flagella
Flagellum
Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University
ナノ生体科学講座 プロトニックナノマシン研究室（難波研究室）
http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labo/09a.html
Flagellin,FliC
Salmonella typhimurium
dispensable
indispensable
プロトニックナノマシンプロジェクト, ERATO
研究成果 (1)
http://www.npn.jst.go.jp/index_jp.html
FliC-His
FliC-His
His-Tag
Beads adsorption
Beads
・Four of cobalt’s six coordination sites are occupied.
・The imidazole rings of histidine residues are able to occupy the
two remaining coordinate sites, resulting in protein binding.
Beads Adsorption
Toxicity-Check
Ni2+
Sender or Receiveｒ
Co2+
Co2+ :1μM-!?
10μM-!?
100μM-!?
1mM-!?
Ni2+ :1μM-!?
10μM-!?
100μM-!?
1mM-!?
Sender
Sender
Sender
AHL
＋
Co2+
aggregated
Receiver aggregation
Receiver aggregation
Sender
AHL
＋
Co2+
aggregated
Quorum Sensing
methionine
Sender
metK
LuxR
S-adenosyl methionine
pTet
LuxI
3OC6HSL(AHL)
O
O
Receiver
HN
Lux
R
O
O
LuxR
pTet
GFP
pLux
Quorum Sensing
methionine
Sender
metK
LuxI
S-adenosyl methionine
pTet
LuxI
AHL
3OC6HSL(AHL)
O
O
Lux
R
HN
O
O
LuxR
pTet
GFP
pLux
Quorum Sensing
methionine
Sender
metK
LuxI
S-adenosyl methionine
pTet
LuxI
AHL
3OC6HSL(AHL)
O
O
Lux
R
HN
O
O
LuxR
pTet
GFP
pLux
Quorum Sensing
methionine
Sender
metK
LuxI
S-adenosyl methionine
pTet
LuxI
AHL
3OC6HSL(AHL)
O
O
Lux
R
HN
O
O
LuxR
pTet
GFP
pLux
AHL quencher ～aiiA～
Sender
LuxI
pTet
AHL
O
O
aiiA
HN
O
aiiA
O
Lacton circle
P cons.
AHL quencher ～aiiA～
Sender
LuxI
pTet
AHL
O
O
aiiA
HN
O
aiiA
O
Lacton circle
P cons.
aiiA inverter Receiver
LuxR
pTet
GFP
pLux
Low AHL conc.
aiiA
cI inverter
High AHL conc.
Senderの数とGFP発現
Sender
Receiver
LuxR
LuxI
pTet
pTet
GFP
pLux
Sender(BW25113 or XL10G),
Methionine (10mM or 0mM)
Receiver
Sender:5×10^8～5×10
Senderの数とGFP発現
methionine
metK
Sender(BW25113 or XL10G),
Methionine (10mM or 0mM)
S-adenosyl methionine
LuxI
Receiver
Sender:5×10^8～5×10
3OC6HSL(AHL)
Methionine 0mM
Methionine
10mM
BW25113
5×10^4
5×10^4
XL10G
5×10^7
5×10^7
AHL synthesis
AHL synthesis
methionine
S-adenosyl methionine
3OC6HSL
O
metK
HO
N
LuxI, acyl-ACP
OH
N
O
O
C
HO
H2 N
NH 2
S+
N
HN
O
NH2
S
O
N
O
O-
O
Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM)
Receiver
Sender:5×10^8～5×10
Quorum Sensing System
LuxI and LuxR
aiiA
SenderとReceiverの選択ができるようにする
Sender
Strong(Super Sender)
Normal
Receiver
Sensitive
Normal
aiiA Receiver
Quorum Sensing System
LuxI and LuxR
aiiA
SenderとReceiverの選択ができるようにする
Sender
Strong(Super Sender)
Normal
Receiver
Sensitive
Normal
aiiA Receiver
sensitive receiver
sensitive receiver (we made)
sensitive receiver (we made)
sensitive receiver (we made)
sensitive receiver test
first mLuxR LuxR
second mLuxR
実験条件をつらつらと
・Receiverの量をいくつに
したか
・AHLの量をどう増やして
いったか
Final-Construction 実験
1. 鞭毛間吸着テスト
（senderとreceiver同士が吸着するか確認）
2. 有限確認テスト
3. Marimo形成テスト
RR
R
R
S
SS
Senderとreceiver
ばらばらのコロニーができる
S
Senderとreceiverを
それぞれ培養し、
receiverにsenderを１
滴加える
Senderとreceiver
くっついたコロニーができる
顕微鏡写真
+imidazol
顕微鏡写真
Non imidazol
Final-Construction 実験
1. 鞭毛間吸着テスト
（senderとreceiver同士が吸着するか確認）
2. 有限確認テスト
3. Marimo形成テスト
有限確認テスト
Sender
RR
R
R
S
SS
S
Senderとreceiverを
それぞれ培養する
Receiverを均一にまく
プレートの真ん中に
senderをスポットする
O/N
AHLを感じたreceiverは
GFPを発現している
Senderからの距離を変えて何箇所
からか菌をとる。
Ｃｏ２＋
まく
R
R
R
R
ＦｌｉＣを発現していない
R
RR
R
R
R
RR
ＦｌｉＣを発現している
FliCを発現していなかったreceiverは、ばらばらのコロニーを
作る。
FliCを発現していたreceiverは塊になったコロニーを作る。
Final-Construction 実験
1. 鞭毛間吸着テスト
（senderとreceiver同士が吸着するか確認）
2. 有限確認テスト
3. マリモ形成テスト
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
Ni2+
R
R
R
R
R
R
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R
R
R
R
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R
R
R
R
S
S S
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R SR
S S R
R
R R
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R SR
S S R
R
R R
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R SR
S S R
R
R R
R
R
R
MARIMO!
AHL
Ni2+