Transcript Receiver - iGEM 2007

物語
バラバラだった大腸菌が・・・
一か所に集まり・・・
Ｖｖ
しだいに大きくなり・・・
有限の大きさで止まります。
私たちのプロジェクトに必要なもの
●大腸菌同士の吸着
→鞭毛にヒスタグを挿入
●大腸菌の一か所への集合
→クオラムセンシング
●大腸菌の集合体の大きさの制御
→AHLクエンチャー
SENDER
tetR
LuxI
tetR
FliC-His
・常にAHLを生産する。
・常にヒスタグ付きの鞭毛を生やす。
RECEIVER
tetR
aiiA
pLux
LuxR
pLux
GFP
FliC-His
・常にaiiAを発現する。
・AHL存在下でGFPを発現する。
・AHL存在下でヒスタグ付きの鞭毛を生やす。
DESIGN
Receiver
Sender
Senderは常にヒスタグ付きの鞭毛が生えているのでニッケルイオンを仲
介して大腸菌同士が吸着します。
Senderは常にAHLを生産します。
DESIGN
Senderが生産したAHLが届く範囲にいるReceiverはGFPを発現し、ヒスタ
グ付きの鞭毛を生やします。
DESIGN
ヒスタグ付きの鞭毛が生えたReceiverはニッケルイオンを仲介として
Senderの周りに吸着します。
DESIGN
ReceiverはaiiAを発現してAHLを分解します。
AHLが届く範囲が狭まり、鞭毛が生えるReceiverが制限され大腸菌の集
合体の大きさが制限されます。
FliC-System
・FliCとはE.coli の鞭毛の主要な
構造タンパク質
・非必須ドメインを 鞭毛の外側に
露出している。
・FliCの非必須ドメインに、任意の
タンパク質を 、鞭毛の機能を損
なうことなく挿入することができる。
Histagged-FliC
Histagged-FliC
His-Tagged-FliC
His-Tagged-FliC
His-Tagged-FliC
・E.ColiはHistag-金属イオン作用
により互いに吸着する。
His-Tagged-FliC
・E.ColiはHistag-金属イオン作用
により互いに吸着する。
Phenotype check
転写
M ①
④ ⑧ pET-49b
⇒FliC-Hisの発現が確認された。
Beads adsorption
原理
・
・
Beads adsorption
RM培地
5mL
30℃
IPTG5μL
Colony Check
inculate
顕微鏡
ビーズ吸着
Beads adsorption
・Colony Check
2000
1500
1000
500
0
・顕微鏡写真
No Metal
FliC-His
Co2+
Ni2+ No plasmid
FliC-His
顕微鏡写真
Toxicity Check
and Cell aggregation
RM培地
5mL
30℃
IPTG5μL
Colony Check
inculate
顕微鏡
Add Ni2+
Co2+
(Stationary)
Toxicity Check
and Cell aggregation
・Toxicity Check
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
・顕微鏡写真
1μM
10μM
100μM
1mM
Ni2+
Co2+
顕微鏡写真
Sender aggregation
RM培地
5mL
30℃
IPTG5μL
顕微鏡
Add Ni2+
Co2+
(Stationary)
Sender aggregation
・
・
・
・
顕微鏡写真
Receiver aggregation
RM培地
5mL
30℃
IPTG5μL
顕微鏡
Add Ni2+
Co2+
(Stationary)
Receiver aggregation
・
・
・
・
顕微鏡写真
Quorum Sensing System
LuxI and LuxR
aiiA
SenderとReceiverの選択ができるようにする
Sender
Strong(Super Sender)
Normal
Receiver
Sensitive
Normal
aiiA Receiver
Quorum Sensing System
LuxI and LuxR
aiiA
SenderとReceiverの選択ができるようにする
Sender
Strong(Super Sender)
Normal
Receiver
Sensitive
Normal
aiiA Receiver
aiiA inverter Receiver
LuxR
GFP
pTet
pLux
Low AHL
aiiA
cI inverter
Low AHL
aiiA
GFP
High AHL
High AHL
Senderの数とGFP発現
Sender(BW25113 or XL10G),
Methionine (10mM or 0mM)
methionine
metK
S-adenosyl methionine
Receiver
Sender:5×10^8～5×10
LuxI
3OC6HSL(AHL)
Methionine 0mM
Methionine 10mM
BW25113
5×10^4
5×10^4
XL10G
5×10^7
5×10^7
AHL synthesis
AHL synthesis
methionine
S-adenosyl methionine
3OC6HSL
O
HO
N
metK
C
HO
OH
N
H2 N
NH 2
S+
N
O
LuxI, acyl-ACP
HN
O
NH2
S
O
O
N
O
O-
O
Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM)
Receiver
Sender:5×10^8～5×10
super receiver
luxR
・AHLの感度をあげるため
LuxRの４５番目のIをFに変え
た、mutantをつくった。
I45F
Super receiver
ｍ
Normal
receiver
super receiver test
sender
sender
Super
Normal
・sender、濃度、株、量等の条件を決めてテストする
現在テストに向けて進行中
super receiver test２
・左図のようなチューブにsuper、
normalともに同じ量ずつ入れてい
く。
super
・加えるsenderまたはAHLの量を
だんだんと増やしていき、superと
normalの発光の違いを観察する。
・こんな実験ができたらいいなと
進行中。
normal
Final-Construction 実験
1. 鞭毛間吸着テスト（senderとreceiver同士が
吸着するか確認）
2. マリモがちゃんと形作れるかテスト
3. サイズの制御テスト
Receiver
O/N Culture
R
R
R
Ni2+
R
R
R
R
R
R
1滴
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R
R
R
R
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R
R
R
R
S
S S
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R SR
S S R
R
R R
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R
R SR
S S R
R
R R
R
R
AHL
Ni2+
S
S
S
Receiver
O/N Culture
R
R
R SR
S S R
R
R R
R
R
R
MARIMO!
AHL
Ni2+