Transcript Fe Sensor - OpenWetWare

The Blood Checkers
IGEM CHIBA
Heme
Oxygenaze
Fe Sensor
2009
Reporter
Our Team
National University Corporation
Chiba University, JAPAN
(Member : )
Kaoru Yamamoto
Kazunao Hareyama
Makoto Nozawa
Satoshi Ishizaki
Yoshimi Iyama
Motivation
消化管の出血の有無を調査するのに最も簡単な方法とし
て便潜血検査があります。
便潜血検査には化学的方法と免疫学的方法の二種類あ
ります。
この二つの方法を組み合わせて、上部消化管からの出血
は化学的方法で、下部消化管からの出血は免疫学的方
法で検査をしています。
ただし、化学的方法は疑陽性があることと、設備が揃って
いない施設が多いため免疫学的方法だけで検査する場
合が大半を占めるのが現状であり、大抵は上部消化管の
検査ができていません。
私たちは上部消化管の胃の出血を検査するシステムをつ
くろうとしている。このシステムが完成すれば上部消化管
の病気の早期発見に貢献するだろう。
System Overview
Biliverdin
Heme
Activate
Heme oxygenase
Generator
Fe Sensor
Reporter
1, Heme Oxygenage Generator
Heme
Oxygenaze
Heme
Heme oxygenase
Generator
Fe Sensor
Reporter
Heme Oxygenage
Heme
Oxygenaze
 Fe is contained in the Heme.
 To pick up Fe, we use this enzyme.
Breakdown of heme
↓
Detection of Fe
↓
Luminescence
At the gut
 Do harm to organisms(←E. coliのほうがいいかも?)
 Express at (場所)←どこでだろう…。未定
 （この有害さを抑える方法をこれから）
Function of Heme Oxygenage
Heme
Oxygenaze
・Catalyser of folowing reaction
Heme + 3 AH2 + 3 O2 → biliverdin + Fe2+ + CO + 3A + 3 H2O
Other
Heme Oxygenage
Heme
2+
Fe
Biliverdin
Information of heme oxygenase
Heme
Oxygenaze
Sequence Length 289 aa
Molecular Weight 32.9295 kD
Isoelectric Point
pH 6.08
Extinction Coefficient
29990 M-1cm-1
Absorption Coefficient
0.91
Aliphatic Index
79.72
MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHIQAENAEFMKNFQKGQVSREGFKLVMASLYHIYTALEEEIERNKQ
NPVYAPLYFPEELHRRAALEQDMAFWYGPHWQEIIPCTPATQHYVKRLHEVGRTHPELLVAHAYTRYLGD
LSGGQVLKKIAQKAMALPSSGEGLAFFTFPNIDSPTKFKQLYRARMNTLEMTPEVKHRVTEEAKTAFLLN
IELFEELQVMLTEEHKDQSPSQMASLRQRPASLVQDTAPAETPRGKPQISTSSSQTPLLQWVLTLSFLLA
TVAVGIYAM
Sequence
Fe Sensor
2, Fe Sensor
Biliverdin
Activate
Heme oxygenase
Generator
Fe Sensor
Reporter
Fe Promoter
Fe Sensor
Reporter
3, Reporter
Biliverdin
Activate
Heme oxygenase
Generator
Fe Sensor
Reporter
Reporter
Sirius
 What is Sirius?
Sirius is an ultramarine fluorescent
protein.
What is amazing?
1.Brightness
2.pH-insensibility
3.The shortest fluorescent emission
wavelength
Reporter
Brightness
Sirius is reported by Takeharu Nagai,a professor of nanosystem physiology at
University of Hokkaido.
It has made from CFP which is a mutant of GFP.
Compared with Y66F mutant that made in the process,the brightness of Sirius is
about 80 times of that of Y66F.
Also E.coli that cultured at 37℃ and that manifested Sirius showed 2 times of
brightness of EBFP.
Thus,this fluorescent protein was named “Sirius” after the brightest and blue star in
fixed stars.
Reporter
pH-insensibility
Thus far,quantities of light of fluorescent proteins became rapidly attenuate
when pH is 7 or lower.
▼
Sirius’s quantities of light of fluorescent doesn’t change in condition of strong
acid because of its pH-insensibility.
This can visualize two or more physiology phenomena in same cell.
By feed ameba bacteria which
expressed Sirius,a series of
process can be observed.
Upper:EGFP
Below:Sirius
The shortest fluorescent emission wavelength
After the cloning is done,a lot of mutants of GFP were developed but the one with
short wavelength was few.
One of the mutant that have short wavelength is BFP,which peak of absorb is 380
nm and peak of florescent is 450 nm.
On the other hand,Sirius has 380 nm of
peak of absorb and 424 nm of peak of
florescent. Also,Sirius isn’t fade easily
and its stability is about 60 times of BFP.
Upper:A fluorescent
spectrum of existing
fluorescent protein and
Sirius
Below:Refined,and excited
these fluorescent protein
4, 胃とその他の区別
Heme
Fe Sensor
Oxygenaze
Biliverdin
Heme oxygenase
Generator
Fe Sensor
Reporter
pH sensor
Heme
Fe Sensor
Oxygenaze
Na+
H+
Na+
Channel
NhaR
NhaA
H+
NhaA
BBa_K116001
Activate
When pH is higher,
it senses the pH
change and starts
to work.
どのような実験やるか
１、生理食塩水とFe(Ⅱ)イオン水の混合液中に大腸菌を入れてみる（回路が機能し
ているか確かめる）
↓
２、擬似胃液、擬似腸液中でも回路が機能するか確かめる
↓
３、血液中で回路が機能するか確かめる
↓
完成？
得られそうなデータ
・１の実験では鉄イオンが塩化物イオンと結合したり錯体形成したりする可能性
がある。
・２の実験では胃液の酸性度で大腸菌が死んでしまうのではないか。
・３の実験ではうまく酵素を働かせられるか心配。
１の実験がうまくいけばシリウス（仮）が光る。
２の実験では多分シリウス（仮）は残って大腸菌は死んでしまうかもしれない。
３の実験はヘムを分解するのでだんだん入力が増えていって光ると思う。
Future Works
Acknowledgement
Prof. Daisuke Umeno
Prof. Taro Toyota
Prof. Kyoichi Saito
Hiroki Fukutomi
Masahiro Tominaga
Maiko Furubayashi
Biomaterial Laboratory Members
Ex – iGEMers