Transcript New Developments in the Management of Kidney Transplant

Immunologie
in der Labormedizin
Konteptvorlesung 2
Themenblock 8
Beda M. Stadler
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KV2 im Überblick
Lernziele: Immunologie in der Labormedizin
• Was sind Immunassays?
• Was versteckt sich hinter
den Abkürzungen?
• Assay Beispiele um
immunologische
Prinzipien zu vertiefen
• Aussagekraft von
Labordaten
• Vertrauensgrenzen
KV 8.2
2
Was ankreuzen?
KV 8.2
3
Selbststudium:
de.wikipedia.org/wiki/Immunoassay
Allgemeine Grundlagen
• Analyt
• Detektionstechniken
• Feste Phase
• Quantifizierung
Assay-Prinzipien
• Kompetitiver Assay
• Nicht-kompetitiver Assay
• Direkter Assay
KV 8.2
4
KV2 im Überblick
Immunologie in der Labormedizin
• Präzipitationsteste
• Agglutinations Teste
• Antigen-Antikörper Teste
•
•
•
•
•
Allgemein
Allergie Diagnostik
Flowzytometrie
HLA Diagnostik
Autoimmun Diagnostik
• Sensitivität und Spezifität von Labortesten
KV 8.2
5
Immunodiffusion
(Ouchterlony Gel)
1
6
1
2
6
2
3
5
3
4
Keine Identität
Identität
A
Antigen
1
Kontrollserum
2
Testserum
2
A
4
KV 8.2
6
A
A
5
1
5
3
4
Partielle
Identität
6
Präzipitinkurve
B
A
C
Anti-B
+
Anti-A
Antigen
Anti-C
Antikörper
Immunkomplex
Immunkomplex
Äquivalenz
Prozone
Postzone
Antigen
KV 8.2
7
Radiale Immunodiffusion
Antikörper im Gel
Ag
Ag
Ag
Diameter2
Ag
Antigen Konzentration
KV 8.2
8
Serum Elektrophorese
gamma
Globuline
beta
alpha2
alpha1
Albumin
+
KV 8.2
Paraproteinämie-Patient
9
Immun-Elektrophorese
Normales Serum
Albumin
Transferrin
IgM IgA IgG
+
-
Antikörper gegen
Serumproteine
Patienetenserum
mit IgA Mangel
KV 8.2
Beispiel
10
Direkter Coombs Test
KV 8.2
11
Der indirekte Coombs Test
Step 1

+
Patienten
Serum
Erythrozyten
Step 2
+

Coombs Reagens
(Antiglobulin)
z.B. anti-RhD Antikörper
KV 8.2
12
Passive Hämagglutination
(Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)
KV 8.2
13
Latex Agglutination
KV 8.2
14
Blutgruppenbestimmung: Geltechnik
monoklonaler Antikörper
gegen Blutgruppen A Antigen
in der oberen Gelmatrix
KV 8.2
Resultat:
Blutgruppe A RhD neg
15
z.B. Schwangerschaftstest
rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG)
in urine specimens
Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase)
Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)
KV 8.2
16
Allergieserologie: welcher Test?
Referenzbereich
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
Anti-b2-Glycoprotein 1 (IgG)
ELISA
U/ml
<15
Cardiolipin-Antikörper (IgG)
SYNELISA
GPL-U/ml
<12
ECP ("eosinophil cationic protein")
FEIA
g/L
2.5-15
Tryptase
FEIA
g/L
1-13.5
Methylhistamin
RIA
µg/g Kreatinin
70-160
Total IgE
FEIA
kIU/L
Allergen-spezifisches IgE
(RAST)
Allergen-spezifisches IgG
FEIA
Rastklassen 0-6
FEIA
mg/L
Präzipitine
Immundiffusion
qualitativ
KV 8.2
(altersabhängig)
0
< 50 mg/L
negativ
17
KV 8.2
18
Immun Assay: RIA & ELISA
Isotop
• Radio
• Immuno
• Assay
Enzyme
markierter
Antikörper
Antigen
Antikörper
•
•
•
•
•
Enzyme
Linked
Immuno
Sorbent
Assay
Messung der
Radioaktivität
oder
Enzymaktivität
KV 8.2
19
ELISA
Markierter Antikörper
Substrat
Enzym
Anti-A
Produkt
A
KV 8.2
20
Sandwich ELISA
Anti-Antikörper
Substrat
Enzym
Anti-A
Produkt
A
KV 8.2
21
Standardisierung
KV 8.2
22
Beispiel: Flowzytometrie
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
HLA-B27
Zytofluorometrie
qualitativ
positiv/negativ
Lymphozyten
Zytofluorometrie
Zellen/l
1200-2800
CD3 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
690-2540
55-84
CD4 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
410-1590
31-60
CD8 absolut
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
190-1140
13-41
NK-Zellen
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
90-590
5-27
B-Zellen
Zytofluorometrie
Berechnung
Zellen/l
% der Lymphozyten
90-660
6-25
KV 8.2
Referenzbereich
23
FACS
sample
nozzle
sheet flow
red fluorescence
prism
green fluorescence
laser
Fluorescence
Activated
Cell
Sorter
right angle scatter
forward scatter
sorted cells
KV 8.2
24
Zellpopulationen
?
KV 8.2
25
CD-Antikörper
CD
Antigen
Funktion
Vorkommen
CD 2
Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer
Aktivierungsweg von T-Lymphozyten
unreife und reife T-lymphozyten
CD 3
T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten,
reife T-Lymphozyten
Signaltransduktion
CD 4
assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an
T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen
MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor
CD 8
Bindung an MHC-Klasse I Moleküle
zytotoxische T-Lymphozyten
CD 14
Rezeptor für bakterielles Endotoxin
(LPS=Lipopolysacharid)
Monozyten, Makrophagen
CD 16
Fc-gamma Rezeptor III
NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen,
Makrophagen
CD 23
niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgE
B-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC)
CD 25
Interleukin-2-Rezeptor
aktivierte T-Lymphozyten
IgM
Antigenrezeptor
unreife + reife B-Lymphos
IgD
Antigenrezeptor
reife B-Lymphos
HLA-DR
MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von
Antigenpeptiden
AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen,
Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos
KV 8.2
26
Eine Immunantwort verfolgen
KV 8.2
27
CD-Marker bei der Diagnose von
lymphohämopoietischen Erkrankungen
Stammzelle
ALL
Prä-B.
frühe B.
mittlere B.
reife B.
plasmozytoide B.
Plasmazelle
PLL, Burkitt
Lymphom
CLL,
foll. L.
HaarzellL.
Waldenström
Myelom
CD19
CD 20
CD 34
CD 52
CD138
KV 8.2
28
Beispiel: HLA Typisierung
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
HLA-B27
Zelllyse
qualitativ
positiv/negativ
HLA-Typ I (A, B, C) (serologisch)
Zelllyse
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ I (A, B)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DR)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DQ)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ II (DP)
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
HLA-Typ Organempfänger
PCR-SSP
qualitativ
Phänotypisierung
T-Zell Cross-match
Zelllyse
qualitativ
negativ
B-Zell Cross-match
Zelllyse
qualitativ
negativ
Leukozytenantikörper
Zelllyse
qualitativ
negativ
KV 8.2
Referenzbereich
29
HLA Typisierung einst...
KV 8.2
30
Überlebensrate Nierentransplantate
Number of HLA mismatches
A&B
0
KV 8.2
DQ & DR
0
A&B
3 or 4
DQ & DR
1 or 2
31
HLA-B27 Typisierung mittels FACS
KV 8.2
32
HLA Typisierung serologisch
KV 8.2
33
PCR
KV 8.2
34
HLA: Molekulare Diagnostik
KV 8.2
35
Array Technologie
„DNA Chips“
KV 8.2
36
Western Blot: Prinzip
KV 8.2
37
HIV: Western Blot
KV 8.2
1.
Lane 1, HIV+ serum
(positive control)
2.
Lane 2, HIV- serum
(negative control)
3.
Lane A, Patient A
4.
Lane B, Patient B
5.
Lane C, Patient C
38
Beispiel: Autoimmunserologie
Analyse
Messprinzip
Masseinheit
Rheumafaktor
Nephelometrie
IU/ml
< 20
Zellkerne (ANA)
IIF
Titer
< 1:80
Thyreoidea Thyroglobulin
Agglutination
Titer
< 1:400
C1-Esteraseinhibitor
(funktionell)
C1q-tragende Immunkomplexe
Fotometrie
70-130%
ELISA
% des
Normwertes
g/ml
Hautbiopsie
DIF
qualitativ
negativ
Schleimhautbiopsie
DIF
qualitativ
negativ
KV 8.2
Referenzbereich
< 35
39
Nephelometry
KV 8.2
40
Immunfluoreszenz
Antinukleäre Antikörper (ANA)
Fluorochrom
markierter AK
Ag
Gewebe
KV 8.2
41
In situ Hybridisierung
KV 8.2
42
FISH
KV 8.2
43
FISH Beispiel
Fluorescent in situ
hybridisation of a
small intestinal biopsy
in a case of Whipple's
disease (confocal laser
scanning microscopy).
Tropheryma whipplei
rRNA is blue, nuclei of
human cells are green
and the intracellular
cytoskeletal protein
vimentin is red.
Magnification
approximately 200 x.
KV 8.2
44
Immunhistochemie
Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink)
in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody
against cytokeratin (green)
KV 8.2
45
Sensitivität und Spezifität
• Sensitivität (epidemiologisch)
• Sensitivität (analytisch)
• niedriger Titer
• Serokonversion
• Verdünnung
KV 8.2
46
oder...
• Sensitivität = Wahrscheinlichkeit,
dass Test bei kranken Personen
positiv ausfällt
• Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass
Test bei gesunden Personen negativ
ausfällt
KV 8.2
47
Genauigkeit der Labordiagnostik
Anzahl richtig positiver
Sensitivität =
X 100%
(Anzahl richtig positiver + Anzahl falsch negativer)
Anzahl richtig negativer
Spezifität =
KV 8.2
Anzahl richtig negativer + Anzahl falsch positiver
X 100%
48
Beispiel
Tatsächlicher Sachverhalt
Testergebnis
positiv
(krank)
negativ
(gesund)
positiv
(krank)
richtig positiv
95
falsch positiv
30
125
negativ
(gesund)
falsch negativ
5
richtig negativ
270
275
Gesamt
100
300
400
Gesamt
Sensitivität: 95 %
Spezifität: 90 %
KV 8.2
49
Aussagekraft der Labordiagnostik
positiver
prädiktiver Wert =
negativer
prädiktiver Wert =
KV 8.2
echt Positive
X 100%
echt Positive + falsch Positive
echt Negative
X 100%
echt Negative + falsch Negative
50
HIV Testung bei der
Gesamtbevölkerung (82Mio)
Falls Sensitivität und Spezifität = 99.9%
HIV-Test
positiv
HIV-Test
negativ
Summe
HIV positiv
HIV negativ
66 933
82 000
67
ca. 82
Mio
148 933
82 Mio
positive Vorhersagewert beträgt nur 45 %!
KV 8.2
51
KV2 im Rückblick
Immunologie in der Labormedizin
• Traditionelle Serologie
• Moderne
immunologische Teste
• Molekularbiologische
Methoden
• Outlook: Point-of-care
testing ?
Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004
„Ein Einblick in die Labormedizin“
http://www.immunology.unibe.ch/wiki/?p=teaching/medical_students/practicle&l=de
KV 8.2
52