Transcript Regulace transkripce u prokaryot

Regulace transkripce
u prokaryot
Regulace transkripce u prokaryot - kapitola 16
Restrikční enzymy - kapitola 5
Molekulární klonování – kapitola 4 a 5
Výsledek testu
60
50
40
2 body
30
3 body
4 body
20
10
0
1
Obecný mechanismus
replikace
•
•
•
•
DNA polymeráza potřebuje RNA primer
Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp)
Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou DNAP
Ligace niků
DNA polymeráza III
• Několik podjednotek
•
•
•
•
•
DnaE (-podjednotka, syntéza)
DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita)
HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu)
DnaN (-podjednotka)
Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex
RT PCR
• Složitá manipulace s geny obsahující
exony
• mRNA již obsahuje sekvenci, která je
translatovatelná
• Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z
retrovirů) vytvoření DNA z mRNA
• Vytvoření jednoho vlákna cDNA –
templátová DNA
• Studium exprese genů
Regulace exprese genů
• E.coli
• Ze 4000 genů je exprimováno v každý okamžik alespoň 1000
• Dle podmínek, geny jsou zapnuty a vypnuty
• Změna teploty  změna exprese 50-100 genů
Figure 16.1
2D Protein Gels of E. coli under Different
Conditions
E. coli was grown in 50 mM acetate or 20 mM
formate. Three gels were run for each condition and
the Figure shows a layered view of two three-gel
composites. The pink and green spots are proteins
induced in acetate or formate, respectively. The
circled spots are those that were statistically
validated, based on a pair-wise comparison of all the
individual gels. (Credit: Joan L. Slonczewski and
Christopher Kirkpatrick, Kenyon College, Gambier,
Ohio.)
Regulace exprese
• Jednobuněčný organismus reguluje expresi svých genů v
závislosti na změně prostředí (teplota, osmolarita, zdroj látek),
či vnitřních signálů (příprava na dělění apod.)
• Regulace probíhá na mnoha úrovních:
•
•
•
•
•
Na úrovni transkripce primárního transkriptu
Na úrovni úpravy primárního transkriptu
Na úrovni stability transkriptu
Na úrovni translace
Na úrovni úpravy a sbalení peptidového řetězce do funkčního
proteinu
• Na úrovni kontroly aktivity proteinu
• Na úrovni degradace proteinu
Efektivní vs rychlá regulace
• Efektivní regulace je na úrovni transkriptu
• Vyžaduje méně energie
• Rychlá regulace je na úrovni proteinu
• Protein je vždy připraven plnit svou funkci
Pozitivní vs negativní regulace
• Pozitivní
• Gen se nepřepisuje, pokud
není aktivován
• Negativní
• Exprese genu je pozastavena
dokud není represor vyvázán
Regulace transkripce
• Na úrovni přístupu transkripčních faktorů k DNA
• Důležitější u E (heterochromatin)
• U P – ne až tak důležitá
• Na úrovni rozeznání promotoru
• U E – tři různé RNAP
• U P – 1 RNAP, ale různé  faktory
• Na úrovni iniciace transkripce
• Nutná přítomnost aktivačních proteinů
• Represor blokuje postup RNAP
• Na úrovni elongace mRNA
• Ne úplně běžné (zpomalení elongacem či předčasné ukončení
transkripce)
• Na úrovni terminace mRNA
• Anti-terminator proteiny
• Umožňuje transkripci genů downstream od terminátoru
 - faktory
•  podjednotka RNAP rozeznává promotor
• Alternativní  faktory
Sigma
factor
Jméno
Housekeeping
70
Stationary phase
Consensus sequence
-35
mezera
-10
RpoD
TTGACA
16-18
TATAAT
38
RpoS
CCGGCG
16-18
CTATACT
Nitrogen control
54
RpoN
TTGGNA
6
TTGCA
Flagellar motion
28
FliA
CTAAA
15
GCCGATAA
Heat shock
32
RpoH
CTTGAA
13-15
CCCCATNT
Extracytoplasmic heatshock
24
RpoE
GAACTT
16
TCTGAT
 Faktor tepelného šoku
• Při vysoké teplotě  proteiny se špatně balí, ztrácí svou
funkcí  agregují
• E.coli
• 37°C – OK
• 43° - pořád OK
• 46°C -  exprese heat shock proteinů (30% z celkového množství
proteinů)
• Chaperony (pomáhají správně sbalit protein)
• Proteázy (degradují špatně sbalené proteiny)
• RpoH a RpoE
RpoH
• RpoH
• 30°C – není potřebný, je rychle
degradován
• 42°C - protein je stabilní,  se jeho
exprese
• 50°C – aktivace exprese dalších heat
shock genů, RpoH je posléze inaktivován
• Transcripce RpoH genu je pod normálním
promotorem (70 – ten je neaktivní při
teplotě nad 50°C) a také pod promoterm
vázající 24 (RpoE, transkripce pokračuje
do 57°C, kdy RNAP je destabilizována)
Formace spory u Bacillus
• Kaskáda alternativních  faktorů
• Když je nouze o výživné látky 
sporulace
•  faktory důležité pro vytvoření spóry
• E a K – v mateřské buňce
• Pre- E – environmentální signály zapínají
expresi
• F a G – ve sporulující buňce
• F – transkripce ranných sporulujících
genů (aktivují pre- E)
• G – transkripce pozdních sporulujících
genů (aktivují pre –K)
Formace spory u Bacillus
• Kaskáda alternativních  faktorů
• Když je nouze o výživné látky 
sporulace
•  faktory důležité pro vytvoření spóry
• E a K – v mateřské buňce
• Pre- E – environmentální signály zapínají
expresi
• F a G – ve sporulující buňce
• F – transkripce ranných sporulujících
genů (aktivují pre- E)
• G – transkripce pozdních sporulujících
genů (aktivují pre –K)
Anti- a anti-anti-sigma faktory
• Anti sigma faktory se vážou na 
faktory a zabraňují nasednutí na
promotor
• SpoIIAB je anti-sigma faktorem
pro F
• SpoIIAA je anti-anti sigma
faktorem a uvolňuje F
Aktivátor vs represor
• Aktivátor – transkripční faktor,
nutný pro expresi genu
• Represor – vypíná expresi genu
• U pozitivní regulace – aktivátor
nutný pro zapnutí exprese
• U negativní regulace – represor
neumožňuje transkripci dokud není
vyvázán
• Indukční činidlo (inducer)
• Obvykle malá signální sloučenina
(živina)
• váže se na regulační proteinu
Operon
• Kluster genů pod jedním promotorem
• Polycistronická mRNA
• Francois Jacob and Jaques Monod – poprvé definovali operon –
negativně regulovaný laktózový operon
• Nobelova cena v roce 1965 (s Andre Lwoff)
Lac operon
• Lac operon:
• lacZ – β galaktosidáza
• lacY – permeáza laktózy
• lacA – acetyláza laktózy (není esenciální)
• LacI – represor
• Upstream of lacAYZ
• V opačném směru
• LacO - operátor
Lac operon
• Lac operon:
• lacZ – β galaktosidáza
• lacY – permeáza laktózy
• lacA – acetyláza laktózy (není esenciální)
• LacI – represor
• Upstream of lacAYZ
• V opačném směru
•
•
•
•
LacO – operátor
Inducer – allo-laktóza, IPTG
Lac operon je vždy trošičku aktivní
Lac operon neni úplně standardní
Negativní represibilní regulace
trp operonu
• Operon pro syntézu tryptofanu – trpEDBCA
• Represor – trpR
• Opačný systém než Lac operon!
Negativní represibilní regulace
trp operonu - atenuace
• U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení
transkripce
• TrpL – leader 130bp
• Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku
• Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp
• Atenuace
• Není to on/off
• Translace je vyladěna na přítomnost trp
araBAD operon
• Jeden protein může být aktivátorem a represorem zároveň
• Aktivátor se obvykle váže před promotor (upstream)
• Pomáhá rozeznat oblast a vazbě na DNA
• Represor se obvykle váže na oblast za promotorem (downstream)
• Brání vazbě RNAP na promotor
• Brání posunu RNAP vpřed
araBAD operon
• Jeden protein může být aktivátorem
a represorem zároveň (vážou se na
různou oblast DNA)
• AraC – regulační protein kontrolující
transport a metabolism arabinózy
• AraBAD (metabolismum) a AraFG
(transport, uptake) operony jsou
reprimovány AraC při absenci
arabinózy, a aktivovány při její
přítomnosti
Ko-represory
• Některé represory jsou aktivní pouze, pokud vážou nějakou
molekulu
• Velmi časté u biosyntetických metabolických drah
• Příklad: arginin
Represory vázající se na
protein
• Mlc
• Represe genů účastnící se
metabolismu glukózy
• Při absenci glukózy, transporter
PtsG je fosforylován
• Přítomnost glukózy vede k jeho
defosforylace
• PtsG váže Mls
• Exprese genů je spuštěna
Kovalentní modifikace
represorů a aktivátorů
• OxyR
• Oxidace OxyR peroxidem vodíku
• Oxiduje –SH skupiny na S-S skupiny – aktivace a vazba na DNA
• Spuštění exprese genů na protekci proti oxidativnímu stresu
• Fnr
• Redukce Fnr spouští jeho aktivní funkci - dimerizuje (např. při
anaerobních podmínkách)
• Aktivace genů důležitých
pro anaerobní respiraci
Dvousložkový regulační systém
• Přidání chemické skupiny pomocí kovalentní
vazby (fosfát, methyl, acetyl, AMP, ADP-riboza
atd.)
• 2 složky
Sensor
• DNA vázající protein, váže DNA pouze když je
fosforylovaný (REGULATOR)
• Kináza vnímavá na změny prostředí (SENSOR)
• Příklady:
• Nedostatek kyslíku (ArcB a ArcA) – reprimuje 20 genů,
které jsou nutné pouze při aerobním metabolismu,
aktivuje 6 genů nutné pro růst za anearobních
podmínek
• Deprivace fosfátu (PhoR a PhoB)
• Metabolismus dusíku (NtrB a NtrC)
Regulator
Globální regulace
• Regulon – skupina genů a operonů, které jsou regulovány
jedním regulačním proteinem při spuštění jednoho signálu
• syntéza argininu ( 12 různých genů/operonů) regulovány jedním
represorem
• Metabolismus cukrů – globální aktivátor Crp
Globální regulace - Crp
• Crp - cyclic AMP receptor
protein
• Crp zapíná geny pro
metabolismus maltózy, laktózy
a dalších při absenci glukózy
• cAMP je signál, že buňka má
málo glukózy
• Lac operon je tudíž řízen
nejenom lacI, ale take Crp
Cyclic AMP
dimer
Regulační nukleotidy
• Regulační nukleotidy
• cAMP
• cAMP je produkování adenylát cyklázou
• Přítomnost glukózy inhibuje syntézu cAMP, stimuluje export cAMP
ven z buňky
• cGTP – vyšší organismy
• c-di-GTP - důležitý pro biofilm produkující baktérie
• Reguluje tranzici mezi volně-plavající a biofilm vytvářející bakterií
• Produkce polymeru N-acetyl-D-glucosaminu
• Biofilm umožňuje baktérií přilnout k povrchu (př. Yersinia pestis, mor,
blecha)
• ppGpp – kontrola hladovění u baktérií
Regulační nukleotidy – druhý
posel
Když je glukóza
Když není glukóza
Když nejsou aminokyseliny
Když nejsou
aminokyseliny
DNA vázající proteiny
• Histone-like proteiny
• Nepřímé
• nespecifické
• H-NS (histone-like nucleoid structuring)
• 2 domény:
• DNA vazebnou doménu
• Protein-protein interakční doménu
• Agregují (tetramery)
• Vazba na A/T bohaté oblasti – reprimují expresi
Regulace na dálku
• HU (heat unstable nucleoid
protein) a IHF (integration host
factor)
•
•
•
•
Pozitivní regulátory
Heterodimery
Ohýbají DNA
Pomáhají tak genovým inverzím,
integracím, rekombinacím
• Regulují expresi přiblížením
regulačních proteinů
Regulace na dálku
• Geny pro metabolismus dusíku
• Alternativní 54 (RpoN)
• Aktivátor NtrC – vazebné místo 140 bp
• Aby byl umožněn kontakt s RNAP
 ohyb pomocí IHF
• Prokaryotický enhancer
Anti-terminace
• Anti-terminace jako kontrolní
mechanismus
• Prevence terminace na
specifickém místě
• Transkripce pokračuje
• Běžné u virů a pro některé
bakteriální geny
• Anti-terminační faktor se váže
na RNAP před dosažením
terminačního místa
Manipulace s DNA
• Restrikční a modifikační enzymy
• Nukleázy
• DNA nukleázy – Dnázy
• RNA nukleázy – Rnázy
• Exonukleázy
• Buď 5‘ nebo 3‘ specifické exonukleázy
• Endonukleázy
•
•
•
•
ssDNA
dsDNA
Specifické (restrikční enzymy)
Nespecifické
Restrikční enzymy
• Vyvinuty jako obrana
baktérie proti cizí
DNA/RNA (např. viry)
• Vysoce specifické
endonukleázy,
rozeznávající 4 až 8 nt
• Štípou obě vlákna
• Mechanismus jak rozlišit
svou DNA od cizí
• Methylace (methylázy)
adeninu, nebo cytosinu
v DNA sekvenci
Restrikční enzymy – typ I
•
•
•
•
Rozeznávací místo tisíce bp od stěpícího místa
Reakce proběhne pouze 1x
ATP dependentní
3 podjednotky
• HsdS - DNA vazebná (rozeznává DNA sekvenci)
• HsdM – modifikační, methyluje DNA
• HsdR - enzym - štípe
Restrikční enzymy - typ II
•
•
•
•
•
•
Rozeznává specifické místo, aktivita je SPECIFICKÁ
Dimer
Nepotřebují ATP
Potřebují kofaktor (MgCl2)
Palindrom (4 – 8 bází)
STICKY konce vs BLUNT konce
Restrikční enzymy – typ II
•
•
•
•
•
Hojně využívány v genetickém inženýrství
Rozeznávají „ inverted repeat – PALINDROM
> několik stovek enzymů
Palindrom 4, 6 či 8 nukleotidů
Isoschizomery:
•
•
•
•
NarI
BbeI
EheI
KasI
GGCGCC
CCGCGG
Restrikční enzymy – typ II
Enzym
Organismus
Sekvence
HpaI
Haemophilus parainlfuenzae
C/CGG
NdeII
Neisseria denitrificans
/GATC
EcoRI
Escherichia coli RY13
G/AATTC
EcoRV
Escherichia coli J62/pGL74
GAT/ATC
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens
G/GATCC
BglI
Bacillus globigii
GCCNNNN/NGGC
NotI
Nocardia aotidis-caviarum
GC/GGCCGC
DraII
Deinococcus radiophylus
RG/GNCCY
Restrikční enzymy – typ II
BamHI
5‘ NNNNNNNGGATCCNNNNNN 3‘
3‘ NNNNNNNCCTAG GNNNNNN 5‘
Restrikční enzymy – typ II
• Uplatnění sticky konců při klonování
Využití restrikčních enzymů
- mapování restrikčních míst
Využití restrikčních enzymů
- RFLP
• Restriction fragment length polymorphisms
• Identifikace organismu
• Forénzní genetika
• Určování otcovství
Využití restrikčních enzymů
- klonování
• Molekulární klonování
•
•
•
•
•
PCR
Ligace do PCR vektoru
Restrikční analýza
Ligace do jiných vektorů
Použití:
• KNOCK-OUT
• KNOCK-IN
• Exprese genů - proteinů
PCR vektor
• pGEM-T easy (Promega)
• XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44
relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].
Modro-bílá selekce
•
•
•
•
V laboratoři při klonování
Gen je klonován do lacZ genu
X-gal
Bílé kolonie jsou pozitivní
Ověření úspěšnosti klonování
•
•
•
•
Namnožení pozitivních bílých baktérií
Izolace plasmidové DNA
Restrikční analýza
Agarózová gelová elektroforéza
• Ethidium bromide (interkalační činidlo)
Ověření úspěšnosti klonování
- realita
PCR
Klonování do PCR vektoru
Klonování do specifického
vektoru
Southern blot analýza
• Jedna z nejpoužívanějších metod molekulární biologie
• E.M Southern (1975)
• Přenos DNA molekul na membránu nylonovou nebo
nitrocelulozovou membránu
• Identifikace specifického restrikčního fragmentu
• Western blot – detekce proteinů
• Northern blot – detekce RNA
Detekce fragmentu pomocí
hybridizace
• Hybridizace:
• Vytvoření značené (radioaktivně) próby
•
•
•
•
Náhodné hexa – deca primery
[-32P] dATP*
dCTP, dTTP, dGTP
DNAPI – Klenow fragment
Detekce fragmentu pomocí
hybridizace
• Hybridizace:
• Vytvoření značené (radioaktivně) próby
• Inkubace s membránou
• Vyvolání na rentgenový film
Důležité pojmy k zapamatování
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pozitivní regulace
Negativní regulace
Alternativní sigma faktor
Anti-terminační protein
Heat shock protein
Chaperon
proteáza
Anti-sigma faktor
Anti-anti-sigma faktor
Indukční činidlo
Operon
Polycistronická RNA
Lac operon
IPTG
Modro-bílá selekce
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Trp operon
Ara operon
Ko-represor
Dvousložkový regulační systém
cAMP
Regulon
globální regulátor
Histone-like proteiny
HU/IHF proteiny
Klonování
Restrikční enzymy
Southern blot
Hybridizace