Transcript Prezentácia programu PowerPoint

UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
Jesseniova lekárska fakulta v Martine
1 Ústav
lekárskej biochémie JLF UK, Martin
2 Neurologická klinika, Univerzitná nemocnica Martin
Vplyv vybraných génových polymorfizmov
receptoru vitamínu D na priebeh sclerosis
multiplex
Čierny Daniel 1, Michalik, J. 2, Dobrota, D. 1, Lehotský, J. 1
14. vědecko-pedagogická konference učitelů biochemických oborů lékařských fakult v ČR a SR
Plzeň, 30. 5. 2013
Etiopatogenéza sclerosis multiplex
• demyelinizačné zápalové autoimunitné ochorenie CNS
• autoreaktívny klon T-lymfocytov → zápal → poškodenie myelínu →
axonálna degenerácia → remyelinizácia → neurologický deficit
Environmentálne faktory
Genetické faktory
• vitamín D
• infekcie – EBV, HSV
• fajčenie
• HLA gény
• non-HLA gény
Epigenetické zmeny
Rýchlosť progresie sclerosis multiplex
Skóre EDSS (Expanded Disability Status Scale, Kurtzke) : 0 – 10
• rozšírená Kurtzkeho škála funkčnej nespôsobilosti
Zneschopnenie
pacienta
• posudzuje hybnosť rúk, schopnosť chôdze,
výkon denných aktivít, sebestačnosť,
schopnosť komunikácie, prehĺtania,
poruchy funkčných systémov
KURTZKE, J.F. 1983.
„malígna“ SM
ČAS
(roky)
„benígna“
SM
EDSS ≥ 3,5
5
EDSS ≥ 4
7
EDSS ≤ 2
EDSS ≥ 5
10
EDSS ≤ 3
EDSS ≥ 6
15
EDSS ≤ 4
EDSS ≥ 6,5
20
EDSS ≤ 5
EDSS ≥ 7
30
EDSS ≤ 6
Vitamín D
• príjem – v potrave, tvorba v koži (UV žiarenie)
• odporúčaná denná dávka – cca 1000 IU
• regulácia kostného metabolizmu
•
imunomodulačné účinky (karcinogenéza, autoimunita)
Imunomodulačné účinky vitamínu D
(Bikle, 2011)
• T-lymfocyty - inhibícia sekrécie INF-γ TH1-ly, zlepšenie funkcie TREG-ly,
↑ tvorby IL-10, posun v smere TH2
• B-lymfocyty – ↓ expresie MHC II molekúl, ↓ tvorby Ig,
↓ diferenciácie plazmatických buniek
• makrofágy a dendritické bunky - ↓ sekrécie IL-12 a TNF-ɑ,
↓sekrécie stimulačných molekúl, ↓ zrenia a chemotaxie DC
Vitamín D a sclerosis multiplex
• vplyv na oligodendrocyty už počas vývinu jedinca
• protektívny efekt voči vzniku SM (Munger et al., 2004)
•
hypovitaminóza D – rizikový faktor vzniku SM
•
denná dávka 400 IU redukuje riziko vzniku SM o 80 % (Simon et al., 2010)
•
plazmatická hladina negatívne koreluje s výskytom relapsov SM
(Soilu- Hanninen et al., 2005)
• v oblastiach mierneho klimatického pásma, tehotné ženy, deti s
anamnézou SM – preventívna suplementácia vit. D (Pierrot-Deseilligny a
Souberbielle, 2011, Chaudhuri, 2005)
• potenciálne liečebné účinky u pacientov s SM (Cadden et al.., 2011)
Mechanizmus účinku vitamínu D
KALCITRIOL v plazme
hydroxylácia
Antibakteriálne účinky
Kostný metabolizmus
Imunomodulačné účinky
vitamín D viažúci
proteín (DBP)
Cieľové tkanivá
VDR - receptor
vitamínu D
Génové polymorfizmy VDR
Ovplyvnenie:
• VDR mRNA – hladina, stabilita, zostrih
• VDR proteín – stabilita, izoformy, interakcie
Génové polymorfizmy VDR a SM
Fok I polymorfizmus VDR
• zámena C / T resp. F / f (SNP rs10735810)
• spôsobuje posun iniciačného kodónu VDR génu
• alelová varianta f (resp. T) - vznik VDR proteínu dlhšieho o 3
aminokyseliny v porovnaní s alelou F
• alela F (resp. C) – kratší VDR proteín divého typu – vyššia
transkripčná aktivita (účinnejšia interakcia s TFIIB)
Fok I polymorfizmus VDR
• protektívny efekt vitamínu D z exogénnych zdrojov – iba u jedincov s
genotypom ff (Simon et al., 2010)
• zníženie rizika vzniku SM – genotyp ff (Partridge et al.,2004)
• nižšia frekvencia genotypu ff u pacientov s vyšším EDSS skóre
(Mamutse et al., 2008)
• u jedincov s genotypom obsahujúcim alelu F nižšia plazmatická
hladina kalcidiolu (Orton et al., 2008)
FF
Ff ff
ApaI a TaqI polymorfizmus VDR
ApaI polymorfizmus
• zámena G / T resp. A / a (SNP rs7975232)
• bez zmeny aminokyseliny, ale mení stabilitu mRNA
• alela A – vyššie riziko vzniku SM (Tajouri et al., 2005)
• alela A – ↑ frekvencia u SM pacientov, ↑ riziko SM v kombinácii s
alelou b a HLA-DRB1*1501 (Niino et al., 2000)
TaqI polymorfizmus
• zámena T / C resp. T / t (SNP rs731236)
• alela t – ↑ frekvencia u SM pacientov, 2-krát ↑ riziko vzniku SM,
3-krát ↑ riziko vzniku progresívnej SM (Tajouri et al., 2005)
Súbor vyšetrovaných jedincov
Doteraz nazbierané vzorky DNA:
160 dobrovoľných darcov krvi
205 pacientov s SM
Vyšetrení jedinci:
PACIENTI SM
SPOLU
100
POMALÁ PROGRESIA
33
RÝCHLA PROGRESIA
21
KONVENČNÁ SM
79
ZDRAVÍ JEDINCI
SPOLU
100
Metodika práce
• odber 5 ml vzorky periférnej krvi
•
izolácia DNA
• amplifikácia DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)
• štiepenie produktu PCR restrikčnými endonukleázami
(FokI , ApaI, TaqI)
• elektroforéza (2% agarózový gél, etídiumbromid)
• vyhodnotenie (UV lampa)
Predbežné výsledky
• 39 pacientov s SM (18 RP SM, 21 PP SM) a 58 zdravých jedincov
S rýchlejšou progresiou SM je asociovaná:
•
•
alela f FokI polymorfizmu (OR = 2,48, 95% CI = 1,14 – 5,35, p = 0,016, vs. CTL)
alela a ApaI polymorfizmu (OR = 2,5, .95% CI = 0,99 – 6,26, p = 0,04, vs. PP SM)
FokI polymorfizmus – alelové frekvencie
80.00%
ApaI polymorfizmus – alelové frekvencie
80.00%
60.00%
CTL
60.00%
CTL
40.00%
SM
40.00%
SM
RP SM
20.00%
PP SM
RP SM
20.00%
PP SM
0.00%
0.00%
alela F
alela f
alela A
alela a
Výsledky – ApaI polymorfizmus VDR
ApaI polymorfizmus VDR - genotypy
AA
Aa
aa
CTL
34
37
29
SM
30
52
18
POMALÁ PROGRESIA
12
17
4
RÝCHLA PROGRESIA
6
7
8
KONVENČNÁ SM
24
45
10
Výsledky – Taq I polymorfizmus VDR
TaqI polymorfizmus VDR - genotypy
TT
Tt
tt
CTL
41
41
18
SM
36
52
12
POMALÁ PROGRESIA
7
22
4
RÝCHLA PROGRESIA
10
7
4
KONVENČNÁ SM
26
45
8
Výsledky – Fok I polymorfizmus VDR
*
*
*
V skupine s rýchlou progresiou SM:
FokI polymorfizmus VDR - genotypy
FF
Ff
ff
• signifikantne vyššia frekvencia alely f
CTL
35
53
12
(vs. CTL: p = 0.02; OR = 2.12; .95 CI = 1.08 – 4.18)
SM
32
52
16
POMALÁ PROGRESIA
9
19
5
RÝCHLA PROGRESIA
3
12
6
KONVENČNÁ SM
29
40
10
(vs. konv. SM: p = 0.02; OR = 2.17; .95 CI = 1.09 –
4.34)
Záver
•
alelové frekvencie polymorfizmov FokI, ApaI a TaqI sa nelíšia
medzi kontrolnou skupinou a SM
•
alelové varianty polymorfizmov ApaI a TaqI nesúvisia s
rýchlosťou progresie SM
•
alela f polymorfizmu FokI je spojená s rýchlejšou progresiou
SM
•
predpoklad - efekt je spôsobený znížením aktivity VDR a
následnou nedostatočnou imunomodulačnou a
protizápalovou funkciou vitamínu D
Ďalšie ciele
• overiť zistené súvislosti vo väčšej skupine jedincov
• analyzovať imunologické a biochemické parametre
• vyšetriť ďalšie génové polymorfizmy metabolizmu vitamínu D
Gén
Funkcia
Lokalizácia
génu
CYP27B1 (25-hydroxy-vitamín D-1αhydroxyláza)
hydroxylácia
12q13
CYP2R1 (mikrozomálna vitamín D
25-hydroxyláza)
hydroxylácia
11p15
DBP (vitamín D viažúci proteín)
transport v plazme
4q12
receptor
12q13
VDR (vitamín D receptor)
CYP24A1 (vitamín D 24-hydroxyláza)
deaktivácia
20q13
SNP
Polymorfná
alela
rs703842
rs10877012
rs4646536
rs10877015
rs118204009
rs118204012
rs118204011
rs10741657
rs10500804
rs12794714
rs7041
rs4588
rs1544410 (BsmI)
rs7975232 (ApaI)
rs731236 (TaqI)
rs10735810 (FokI)
rs11568820
(Cdx2)
rs2254210
rs98784
rs2296241
C/T
G/C
C/T
A/G
A/G
A/G
C/T
A/G
G/T
A/G
G/T
A/C
T/C (B/b)
T/G (A/a)
T/C (T/t)
C/T (F/f)
G/A
A/G
C/T
A/G
Spolupráca
• Ústav lekárskej biochémie JLF UK
• Neurologická klinika UNM
• Národná transfúzna služba v Martine
Ďakujem za pozornosť!