Transcript 實驗背景
分子生物學實驗(一) 實驗一 蘇力菌質體DNA抽取與 洋菜膠電泳分析 指導老師：蔡銘祝 1 目錄 實驗背景 實驗目的 實驗原理 實驗設備及材料 實驗方法 實驗結果 問題與討論 2 實驗背景 蘇力菌是一種昆蟲病原細菌，屬革蘭氏陽性桿菌，在營 養缺乏或環境不良的時候，蘇力菌會進入不分裂的半靜 止期，或分化形成孢子和殺蟲晶體蛋白質。 殺蟲結晶蛋白質 孢子 3 實驗背景 • 質體是一種環狀的DNA分子，通常只有數千個鹼基配 對(kilo-base, kb)，期生理特性與染色體相同，同樣具 有自我複製的能力。 • 表現蘇力菌殺蟲晶體蛋白質的基因，稱為cry基因，大 多位在大小約60-300 kb的質體上(plasmid)。 • 在同一個質體上，時常具有一種以上cry基因同時存在。 4 蘇力菌殺蟲晶體蛋白質之分類 Cry是殺蟲基因名稱，其中包含以下幾種： • Cry1對鱗翅目有毒殺蟲效果。 • Cry2對鱗翅目及雙翅目或單獨對雙翅目有效。 • Cry3只對鞘翅目有效。 • Cry4只對雙翅目有效。 5 實驗目的 本實驗以市售見達利生物性農藥產品為檢測物，上 面標示具有毒殺鱗翅目昆蟲的蘇力菌殺蟲基因，進一 步培養其中之蘇力菌，並且抽取含有殺蟲基因之質體 (plasmid)，以作為後續蘇力菌殺蟲基因檢測(PCR)之 模板DNA或限制酶切割及電泳分析等分生實驗。 6 實驗原理 •自見達利生物性農藥中大量增殖蘇力菌，利用改良式 鹼裂解法(Modified Alkaline lysis method) 使菌 體分解或破碎，以釋出質體DNA，配合管柱層析法 (column chromatography)方法，將質體DNA純化萃取 完成。 7 實驗設備與材料 • 材料 1. LB(Luria-Bertani )培養液 2. 微量離心管、微量吸管(Pipette) 3. 見達利蘇力菌生物性農藥 4. 質體DNA 抽取套組 5. 洋菜膠(agrose) 6. TAE Buffer 7. 6X DNA loading dye 8. HealthView Nucleic Acid Stain • 設備 1. 滅菌釜 2. 無菌操作台 3. 迴轉式培養器 4. -20℃冰箱 5. 震盪器 6. 桌上型離心機、高速離心機 7. DNA水平電泳槽(Major Science) 8. 鑄膠器套組 9. 冷螢光照相系統 8 實驗方法 一、蘇力菌隔夜培養 1、先配置LB培養液 9 2、將配置好的培養液放進滅菌釜殺菌2小時。 10 3、秤取0.01g蘇力菌粉末，在無菌操作台將其接種到LB培養液中。 11 4、將接種完成之LB培養液，放置旋轉培養器中，調整140 rpm， 25℃隔夜培養。 5、隔夜培養後的成果，沉澱物是蘇力菌的菌體。 13 二、收集蘇力菌質體DNA流程 離心收集菌體 打破蘇力菌之菌體 中和反應 蘇力菌質體DNA結合到親和性管柱上 清洗雜質 沖提回收蘇力菌質體DNA 質體DNA可長時間保存於-20℃冰箱 細部流程請同學參 照老師上課講解之 英文實驗步驟 萃取蘇力菌質體DNA利用之實驗套組 蘇力菌質體抽取套組：PD1、 PD2、 PD3 Buffe 、 W1 Buffer、Wash Buffer 15 三、洋菜膠體電泳 1. 將上週保存於-20℃之蘇力菌質體DNA解凍，混 合均勻後，在室溫中以微量離心機離心5秒鐘， 使溶液集中於微量離心管底部 2. 製作1.5%洋菜膠(取1.5克之洋菜粉溶解於100毫升 之1倍TBE緩衝液中，以微波爐加熱煮沸，待降 溫後，加入1ul HealthView Nucleic Acid Stain進 行後續質體DNA染色 3. 然後將洋菜膠倒入鑄膠槽中，於鑄膠器上方加入 塑膠檢體齒，待其完全冷卻並凝固後方可使用)， 如下圖所示 16 以1倍TAE電泳緩衝溶液配置1.5%洋菜膠。 圖2 圖1：秤1.5%洋菜膠 圖1 圖2：TAE電泳緩衝溶液 17 1.5%洋菜膠配置步驟 18 4.將含洋菜膠之膠片盤置於核酸電泳槽中，倒入1倍TAE緩衝液至洋 菜膠表面淹沒為止。 5.取5µl之DNA標幟(1kb marker)與5μl質體DNA，分別與1μl的6倍染 劑在臘膜上以微量吸量管進行混合。 19 6. 緩慢的將上述樣品注入1.5%洋菜膠樣品槽中 20 7. 蓋上電泳槽蓋，正確接上正、負極，通以100毫伏特之電壓約 30分鐘，注意染劑移動的位置。 8. 當染劑距洋菜膠下方約1.5公分時即完成電泳步驟，關閉電源。 21 四、質體DNA電泳結果影像擷取 1、將膠體樣品放入冷螢光照相系統。 22 2、蓋上蓋子後，開啟Omega Lum G程式，進行拍照。 23 3、擷取影像結果為下圖。(參考用非實驗真實影像結果) 24 結果(參考用非實際結果) Mr 1 2 3 4 5 6 7 1：Cry1A(490bp) 2：Cry1B(367bp) 3：Cry1C(1160bp) 4：Cry1D(290bp) 5：質體1 6：質體2 7：質體3 1500bp － 1000bp － 750bp － 500bp － 250bp － 商業上所使用的蘇力菌種─aizawai─的Cry 基因圖譜。PCR的結果以1.5%的洋菜膠體 電泳進行檢視，所使用的分子量標記(Mr) 大小如圖左標示。 25 問題與討論 1. 請說明那些因素會影響抽取質體DNA之品質與濃度? 2. 請同學討論蘇力菌質體DNA萃取量偏低之可能原因? 3. 蘇力菌質體DNA使屬於high copy number或low copy number之質體DNA，試說明解釋? 4. 萃取之蘇力菌質體DNA，在進行後續限制酶切割、聚合酶 連鎖反應、DNA定序等實驗，如果發現結果不佳，有可能 是那些原因造成，試說明解釋? 5. 本實驗利用DNA電泳可以將蘇力菌質體DNA進行半定量分 析，請問如何更精準定量蘇力菌質體DNA之含量? 6. 請問同學如何檢測所萃取蘇力菌質體DNA之純度? 26