Transcript A 種流程圖 PowerPoint file

Protein
Purification
Techniques
純化 分析
Gel filtration
Disc-PAGE
Ion exchange
SDS-PAGE
Affinity
chromatography
層析法
電泳法
Western transfer
定 量 分 析
Activity assay
Protein assay
蛋白質實驗所用到的操作技術：
實 驗
層 析 法
電 泳 法
定 量 分 析
1
Gel filtration
2
Ion exchange
3
Affinity
SDS-PAGE
Assay
4
Gel filtration
Protein transfer
Assay
Immunostaining
Assay
5
其 它
Protein fractionation
Assay
(Dialysis)
Molecular weight
Protein Purification
各實驗進行流程圖
Extraction
Transformants
XT
大量培養
P1
TP
Ammonium sulfate
fractionation
4.2.1
4.2.2
4.1.1
P3
全蛋白質
定量及活性
P2
P9
P4
4.1.2
P5
4.1.3
4.1.4
Gel filtration
Ion exchange
Affinity
chromatography
GF
IEX
AF
4.1.2
分子量
測定
XT TP GF IEX AF 樣本收集
P6
P8
抗
体
檢
定
4.2.5
Western
transfer
P7
4.2.3
4.2.4
optional
P3
轉印
4.2.1
4.2.2
比較
純化效果
SDS-PAGE
定量及活性
Protein Purification:
P1 Crude extraction, P2 Gel filtration
公用 pool, 4¢J
¡¾ CBG
¡¾ pNPG
¡´ Buffer A-150
C16 column,
stand, clamp, level,
Buffer A-150 (1 L),
S-300 gel (200 mL)
START
11
Sephacryl S-300
column packing
懸
濁
均
勻
+ Lysis buffer 10 mL
1
下
午
1
◆ Demo:
Column
packing
樣本菌體已在
上週準備完成
冰筒,
液態氮
Cell pellet
Culture
溫水浴
◆ Demo:
Cell eruption
Freezing-thawing
破菌
離心去除沉澱
2
今天一
開始請
先裝填
管柱！
每一重要步驟要保
留 0.1 mL 做為樣本
Crude extract
粗抽取液
共¡Ä¡Ä¡Ä mL
XT
Ammonium sulfate
fractionation
Check 天平
監督秤量
硫酸銨¡Ä¡Ä¡Ä gm
以 70% 飽和度硫酸銨
把蛋白質沉澱下來
3
1
離
心
收
集
高速離心收集沉澱
Total protein
全蛋白質
4
溶於最少量緩衝液
離心去除沈澱
Column washing
用高壓徹底流
洗膠體，以便
使膠柱緊密裝
填好。
公用 pool 4¢J
Sample bags
每一重要步驟要保
留 0.1 mL 做為樣本
TP
◆ Teach:
Fraction collector
Test tube
100s
共¡Ä¡Ä¡Ä mL
Gel filtration
進行過夜
P3
請小心調好分劃
收集器，並注意
運作是否正常！
Protein Purification:
P3 Protein Assays, P4 Ion Exchange
◆ Demo:
Column packing
DEAE Sephacel
column packing
P2
¤W
¤È
10
DEAE gel
預先平衡
Sephacryl S-300
fractions
P3
Activity assay
TA Check:
CBG, pNPG
Column
washing
回溫
注入管柱
Econo column,
stand, clamp,
Buffer A-0 (50 mL),
DEAE gel (15 mL)
GF
2
下
午
1
Ion exchange
2
Washing
Bradford assay
11
◆ Teach:
EIA reader
作圖
Gel filtration
chromatogram
◆ Teach:
SigmaPlot
Buffer A-0
(50 mL)
Stepwise
elution 0.3 M
elution 0.5 M
3
收集活性區部份
Buffer A-300
(50 mL)
Buffer A-500
(50 mL)
收集各梯度分劃
4
2
DEAE Sephacel
fractions
DEAE gel
收回再生
濃縮
Diafiltration
◆ Teach:
Centriprep-30
桌上型離心機
P3
進行分析並作圖
收集活性區部份
Cetriprep-30
收濃縮液
共¡Ä¡Ä¡Ä mL
GF
Gel
filtration
column
小
心
保
留
P9
每一重要步驟
要保留 0.1 mL
做為樣本
分子量測定
共¡Ä¡Ä¡Ä mL
IEX
保存於 4℃
Protein Purification:
P5 Affinity Chromatography
Ni-NTA gel
(25 mL)
已平衡好
已裝填好
¤W
¤È
10
Affinity
Column
packed
IEX 樣本
要回溫
IEX
Buffer
B-300/0
(20 mL)
P5
Affinity
chromatography
11
3
Buffer
B-300/20
(30 mL)
Buffer B-300/20
10% SDSpolyacrylamide
gel casting
洗出雜質
3
◆ Demo
Gel casting
¤U
¤È
3
Washing
Buffer
B-300/250
(30 mL)
鑄膠組合,
鑄膠溶液
P6
4
Affinity elution
鑄造兩片
SDS-PAGE
電泳膠片
Buffer B-300/250
收集溶離分劃
¤U
¤È
1
準備備用膠片
5
Elution fractions
Affinity gel
收回再生
P3
SDS-PAGE gel
2
Activity assay
Bradford assay
作圖
Affinity
chromatogram
收集
共¡Ä¡Ä¡Ä mL
AF
保存於 4℃
完成所有樣本採集
Protein Purification:
P6 SDS-PAGE, P7 Protein transfer
P2
◆ Demo:
Gel running,
Power supply
¤W
¤È
10
Gel filtration column
分發:
BSA,
標準品
分發:
Gel running kit ,
LMW Marker,
Solution F,
電泳用 tip
電泳樣本
沸水浴
XT TP GF IEX AF Marker
XT TP GF IEX AF
P6
P3
4
Electrophoresis
150V, 90 min
¤U
¤È
1
11
Bradford assay
分別進行
2
染色半小時
再脫色至
背景清澈
Check:
排煙櫃,
CBR,
脫色液,
旋轉台,
看片箱
P7
高電流轉印
400 mA, 1.5 hr
3
4
早上可以開
始處理樣本
4
流洗
Western
transfer
CBR staining
以標準蛋
白質校正
線定出每
個樣本的
濃度
Check:
轉印槽,
三明治,
PVDF,
甲醇,
濾紙,
緩衝液,
Urea-PBST
分發:
GF Marker
(0.4 mL) 加入
AF 0.5 mL
Molecular
weight
marker
加入
AF
Protein
blot
玻璃片,
玻璃紙
膠片乾燥
Urea washing
過夜
護貝機,
護貝膜
P8
PAGE
結果
免疫染色
離開前注入樣本
分離過夜
請小心調
好分劃收
集器，檢
查運作是
否正常！
P9
分子量測定
Protein Purification:
P8 Immunostaining, P9 MW Determination
公用 pool
要準備一大
桶公用的
PBST
分子量測定
免疫轉印
P9
P7
10
XT TP GF IEX AF
11
Protein
blot
Gel filtration
fractions
P3
NET-gelatin
填塞
t
1s
5
P3
b
A
1
Activity assay
加入抗體探針偵測
H
R
Activity assay
Bradford assay
P
2
Bradford assay
Standard curve
bA
d P
2 n HR
Standard curve
3
GUS
4
Enzyme
staining
DAB
基質液要新
鮮製備分發
由標準曲線
求得分子量
END
轉印結果
Immunoblot
計算各方法
的純化效果
純化效果
Purification
table
optional