Transcript 4 - DNA and Chromosomes

ADN et
chromosome
Le nucléosome
1
• Dimethylated
Lys 9 of dans
Histone
H3 is de souris
Domaines
hétérochromatiques
un noyau
shown in green, the Swi/Snf core
ATPase Brg1 in red, and DNA in blue.
The image was obtained using a Nikon
Microphot FX fluorescence microscope.
Scale bar represnts 3 µm.
• The winner would like to acknowledge
the support of his advisor, Erik Knudsen,
and technical assistance from Nancy
Kleene (both at the University of
Cincinnati College of Medicine, USA).
Solomon,D 2004,
Nat cell Biol :
Heterochromatic
domains in a
mouse nucleus
3 m
2
Plan
I - Structure et fonction de l'ADN
II - ADN chromosomique et emballage
dans la fibre chromatinienne
– organisation des gènes le long de la
molécule d'ADN
III - Structure globale des chromosomes
– emballage de la molécule d'ADN dans les
chromosomes
3
III - Structure globale des
chromosomes
1. Chromosomes en écouvillon
2. Chromosomes polytènes de la drosophile
3. Hétérochromatine / Euchromatine
a – État de la chromatine  expression des gènes
b – Télomères
c – Centromères
d - Défense contre les éléments mobiles d'ADN
4. Chromosomes mitotiques
5. Organisation des chromosomes dans le
noyau interphasique
4
Structure globale des
chromosomes (Rappel)
I - ADN
II - Nucléosomes  30nm (0,1 cm de
long)
III - 30nm  organisation supérieure
même en interphase
– Mal compris : boucles, enroulements
5
1 - Chromosomes en écouvillon
• Dans une cellule en interphase, on ne voit pas les
chromosomes (trop petits et trop emmêlés)
• MAIS il y a quelques exceptions où on voit l'organisation
supérieure des chromomes
• ET on pense que certaines caractéristiques sont
représentatives pour tous les chromosomes
• Un exemple : les chromosomes appariés de l'ovocyte
d'amphibien
– très actifs en transcription
– forment des boucles de chromatine rigides et déroulées
–  le nom de chromosome en écouvillon
– visibles en microscopie optique
6
• Chromosome en écouvillon (4 molécules
d'ADN par chromosome) Microscopie
optique
Fig 4-36(A)
0,1 mm
7
• Microscopie optique à fluorescence AC
contre les protéines de maturation de
l'ARN
• La plupart des gènes portés par la
boucle d'ADN est en cours d'expression
Fig 4-36(B)
20 m8
• Structure du
chromosome en
écouvillon
– Environ 10 000
boucles au total
– La plupart de l'ADN
est condensé en
chromomère
Fig 4-37
– Chaque boucle
correspond à une
séquence d'ADN
spécifique
– 4 copies de chaque
boucle (diplotène)
9
Chromosomes en écouvillon :
illustration du phénomène suivant
• La chromatine dont l'ADN est utilisé est
décondensée
• La chromatine dont l'ADN n'est pas
utilisé est condensée
10
Applications du modèle
chromosomes en écouvillon
• Dans les chromosomes en écouvillons
correspondance précise
• Mais rarement observé dans les autres
espèces
11
Applications du modèle
chromosomes en écouvillon
• De l'ADN de poisson (sans
chromosomes en écouvillons) prend la
forme de chromosomes en écouvillon
quand on l'injecte dans l'ovocyte
d'amphibien  hypothèse :
• Les chromosomes en interphase de
tous les eucaryotes sont organisés en
boucles trop petites et trop fragiles
pour être observables
12
Applications du modèle
chromosomes en écouvillon
• Modèle d'étude pour l'ADN de
mammifère qu'on injecte dans un
ovocyte d'amphibien
• Corrélation
– boucle
– gène
– séquence d'ADN
13
2 - Chromosomes polytènes de
la drosophile
• Autre exemple de chromosome
interphasique visible au microscope
optique
• Plusieurs milliers de molécules d'ADN par
chromosome = chromosome polytène
• chromosome polytène = 1 chromosome
avec beaucoup de molécules d'ADN
• Cellule polyploïde = plusieurs lots de
chromosomes avec chacun une molécule
d'ADN
14
Chromosomes polytènes de la
drosophile
• Très étudié dans les cellules des
glandes salivaires de larve de
drosophiles
• 10 réplications sans séparation des 4
chromosomes  210 (= 1024) molécules
d'ADN par chromosome
15
• Lot complet de
chromosomes
polytènes dans une
cellule de glande
salivaire de drosophile
• 4 paires de
chromosomes
différents (2n = 8)
Fig 4-38
• Chaque paire est
appariée  chaque
paire apparaît comme
une seule structure
16
• Microscopie optique d'une portion
de chromosome polytène
• Alternance de
bandes sombres (95% de l'ADN) et
d'interbandes claires (5% de l'ADN)
• Une bande ou interbande = 1024
séquences d'ADN alignées en phase
• Une bande = 3 000 à 300 000
paires de nucléotides
Fig 439
10m
• Chaque bande est reconnaissable et
numérotée
• Environ 5 000 bandes et 5 000
interbandes
17
• Microscopie électronique de chromosome
polytène
Chromatine
moins
condensée
Fig 4-40
•Chromatine plus
condensée
•ou contient plus
de protéines
•ou les deux
18
Signification des bandes et
des interbandes
• Toujours pas de réponse claire depuis 1930
• On a pensé que (faux)
– nombre de bandes  nombre de gènes 
– une bande  un gène
• En fait c'est faux et
– Nombre de gènes  3 X nombre de bandes
– On trouve des gènes dans des bandes et interbandes
– Certaines bandes ont plusieurs gènes
– Certaines bandes n'ont pas de gènes
19
Signification des bandes et
des interbandes actuellement
• Bande / Interbande est le reflet de différents niveaux
d'expression génique
• Interbandes
– chromatine moins compacte
– gènes plus exprimés
• Bandes
– chromatine plus compacte
– gènes moins exprimés
• Le chromosome polytène est le reflet de la nature
hétérogène de la compaction de la chromatine de tous
les chromosomes interphasiques
20
Ecdysone
• Hormone stéroïde qui contrôle
l'expression des gènes des
chromosomes polytènes de la
drosophile
• Taux montent et descendent en
fonction du dévelopement larvaire
–si le taux monte les gènes codant
pour les protéines s'expriment
21
Boursouflures chromosomiques
(= "puffs" = nodules)
• Au fur et à mesure du dévelopement
des boursouflures chromosomiques
apparaissent puis disparaissent quand
de nouveaux gènes s'expriment ou
s'éteignent
• Un puff  décondensation d'une bande
22
• Renflements
chromosomiques
(bras gauche du
chromosome 3) :
apparition et
disparition des
renflements
chromosomiques
le long du
chromosome
polytène
Fig 4-41
22 heures
• Chacun des 5
"puff" n'est actif
que pendant une
courte période
23
Anneaux de Balbiani
• "Puff" particulièrement grand d'un
chromosome polytène
• Arrangement de la chromatine en boucles
(comme dans les chromosomes en
écouvillon)
• Visibles en microscopie électronique
• Surtout (≈que) dans les cellules des glandes
salivaires du moucheron Chironomus tentans
• Chaque boucle contient un gène unique
24
• Synthèse d'ARN dans un "puff" chromosomique
(Chironomus tentans) AC anti BrU
Nouvel ARN à partir
d'un anneau de
Balbiani
ARN synthétisés avant
l'addition du BrUTP
ayant diffusé de
l'anneau de Balbiani
ARN synthétisés à partir
d'un l'anneau de
Balbiani avant l'addition
du BrUTP
Fig 4-42(A)
25
Un "puff" d'un
chromosome
polytène
Fig 4-42(B)
26
Fig 4-43(gauche)
• Chromosome polytène de Chironomus tentans
•
Coupe dans un anneau de Balbiani (l'ensemble est un "puff")
27
Daneholt,B2001p7012
Salivary gland cells in the larvae of the dipteran Chironomus tentans
offer unique possibilities to visualize the assembly and
nucleocytoplasmic transport of a specific transcription product.
Each nucleus harbors four giant polytene chromosomes, whose
transcription sites are expanded, or puffed. On chromosome IV,
there are two puffs of exceptional size, Balbiani ring (BR) 1 and BR
2. A BR gene is 35–40 kb, contains four short introns, and encodes
a 1-MDa salivary polypeptide. The BR transcript is packed with
proteins into a ribonucleoprotein (RNP) fibril that is folded into a
compact ring-like structure. The completed RNP particle is released
into the nucleoplasm and transported to the nuclear pore, where
the RNP fibril is gradually unfolded and passes through the pore.
On the cytoplasmic side, the exiting extended RNP fibril becomes
engaged in protein synthesis and the ensuing polysome is
anchored to the endoplasmic reticulum. Several of the BR particle
proteins have been characterized, and their fate during the
assembly and transport of the BR particle has been elucidated. The
proteins studied are all added cotranscriptionally to the pre-mRNA
molecule. The various proteins behave differently during RNA
transport, and the flow pattern of each protein is related to the
particular function of the protein. Because the cotranscriptional
assembly of the pre-mRNP particle involves proteins functioning in
the nucleus as well as proteins functioning in the cytoplasm, it is
concluded that the fate of the mRNA molecule is determined to a
considerable extent already at the gene level.
28
Daneholt,B2001p7012(fig1)
Electron micrograph showing
chromosome IV with its three giant
puffs (Balbiani Rings) in a salivary
gland cell from C. tentans. The three
BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated
as well as the nucleoplasm (Npl) and
cytoplasm (Cpl). The arrows mark a
Electron
showing
chromosome IV with loops
its three giant
fewmicrograph
prominent
transcription
(cf.puffs
(Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs
Fig.
(Bar
equals
2 as
μm.)
(BR1,
BR2,2D).
and BR3)
are indicated
as well
the nucleoplasm (Npl) and
cytoplasm (Cpl).
29
Intracellular distribution of the
cap-binding protein CBP20 in C.
tentans salivary gland cells
studied by immunoelectron
microscopy. The assembly of the
BR RNP particle is shown in A–
D: proximal portions of the BR
gene are displayed in A, distal
portions in B and C, and a
schematic drawing of the BR
gene in D (p, proximal; m,
middle; d, distal portions of the
gene). The fate of the released
BR particles is shown in E–H: BR
particles are present in the
nucleoplasm (E), at the pore (F),
and in an unfolded conformation
when passing through the pore
(G and H). Gold particles are
marked by arrows and indicate
the position of CBP20. It should
be noted that gold particles are
at the leading 5′ end of the BR
particle when it passes through
the nuclear pore.
(Bar equals 100 nm.)
Daneholt,B2001p7012(fig2)
30
Assembly and transport of the BR RNP particle and its relation to a number of BR RNA-associated
proteins. The BR particle is assembled on the gene (left), passes through the nucleoplasm, unfolds,
and translocates through the nuclear pore (middle). On the cytoplasmic side, the BR RNP fibril
becomes engaged in protein synthesis and the polysomes anchor at the endoplasmic reticulum
(right). The tripartite nuclear pore complex with its central channel is seen in black and its nuclear
and cytoplasmic fibers are presented in pink. The BR gene with its five exons is displayed above the
BR particle scheme, and the flow patterns of the BR RNA-associated proteins are outlined below.
snRNP, small nuclear RNP.
Daneholt,B2001p7012(fig3)
1, 2, 3, 4, 5 : exons
BR RNA-associated
proteins
31
• Boucle de
chromatine
dans un anneau
de Balbiani
Fig 4-42(droite)
32
Conclusions sur les anneaux de Balbiani
• Quand le gène s'exprime, la fibre de
chromatine de 30 nm se décondense mais
garde ses 4 histones
• Par défaut la fibre est sous la forme 30 nm
• Peuvent décondenser cette fibre :
– les modifications des histones
– les complexes de remodelage de la chromatine
– les protéines de régulation de l'expression des
gènes
• La boucle serait un domaine fonctionnel
indépendant
33
Extrapolation
• Tout l'ADN des chromosomes polythènes
est organisé en boucles qui se
condensent et se décondensent
• Tous les chromosomes interphasiques de
tous les eucaryotes sont emballés en
boucles contenant quelques gènes dont
l'expression est régulée de façon
coordonnée
34
20 000 à 100 000
paires de
nucléotides
• Modèle de
structure du
chromosome
interphasique
• Déduit à partir de
quelques cas rares
Fig 4-44
35
3 - Hétérochromatine /
Euchromatine
a. État de la chromatine  expression
des gènes
b. Télomères
c. Centromères
d. Défense contre les éléments mobiles
d'ADN
36
Historique (1938)
• Deux types de chromatine en
interphase (MO)
– Hétérochromatine : toujours condensée
(même en interphase)
– Euchromatine : le reste
37
Actuellement
• Euchromatine ( fibre de 30 nm et
boucles)
• Hétérochromatine
– contient des protéines supplémentaires
– Plus compacte
–  10 % du génome est hétérochromatique
– Régions spécifiques : centromères et
télomères
38
Hétérochromatine
• Son ADN ne contient presque pas de gènes
• Les gènes emballés dans de l’hétérochromatine ne
peuvent pas s’exprimer
• Fonctionnement des télomères et centromères
• Certains gènes ont même besoin d’être localisés
dans de l’hétérochromatine pour s’exprimer
• Le mot hétérochromatine comprend plusieurs types
de structure de chromatine avec un très haut degré
d’organisation
• L’hétérochromatine n’est pas un emballage d’ADN
"mort"
39
a - Expression de
l'hétérochromatine
• Un gène qui s'exprime dans de
l'euchromatine ne s'exprime plus s'il est
localisé dans de l’hétérochromatine : il
devient "silencieux"  exemple d'effet
de position
• Effet de position : l'activité d'un gène
dépend de sa position le long du
chromosome
40
Effet de position
• Découvert chez la drosophile
• = influence de l'état de la chromatine le
long du chromosome sur l'expression
du gène 
• Chromosome = mosaïque de formes
différentes de chromatine dont chacune
a un effet particulier sur la capacité de
l'ADN à être sous le contrôle de la
cellule
41
Deux exemples de diversification
par effet de position
• 1 - Gène ADE2 de la levure
• 2 - Gène white de la drosophile
42
Exemples de diversification par
effet de position 1/2 : Gène
ADE2 de la levure
• Gène ADE2 de la levure
– Position normale  expression
– Position près du télomère (hétérochromatique) 
pas d'expression
• ADE2 code pour une enzyme de la synthèse
de l'adénine
• Si absence  accumulation de pigment rouge
• Parfois le gène redevient actif dans la
descendance : emballage moins serré de
l'hétérochromatine
43
• Exemples de diversification par effet
de position : Gène ADE2 de la levure
Fig 4-45 (A)
44
Exemples de diversification par effet de
position 2/2 : Gène white de la drosophile
• Le gène white contrôle la couleur des yeux
• Gène white normal (allèle sauvage white +  yeux
rouges)
• Gène white muté (allèle muté white -  yeux blancs
[d'où le nom])
• Le gène white normal (white +)
– Position normale  expression  yeux rouges
– Position proche de hétérochromatine  pas d'expression 
yeux blancs
– En fait mottes rouges et blanches : présence de rouge car
pas d'inactivation pendant la période embryonnaire
45
• Exemples de diversification par effet de position : Gène
white de la drosophile
Fig 4-45 (B)
46
Deux exemples de diversification
par effet de position : gène ADE2
de la levure et gène white de la
drosophile
•
Un gène peut se réactiver (colonies rouges
et blanches, yeux avec mottes rouges et
blanches)
•
Une fois réactivé, transmission aux cellules
filles
•
Si emballé avec l'hétérochromatine,
inactivation transmises aux cellules filles
47
Deux caractères de
l'hétérochromatine
• Dynamique
–Peut s'étendre puis se retirer
• État héritable d'une cellule à la fille
–Explique la "diversification par effet
de position"
48
• ADN limitant empêchant
l'hétérochromatine de déborder sur
l'euchromatine (peut disparaître au cours
de remaniements)
Fig 4-46(A)
49
• Débordement variable de l'hétérochromatine au
cours du développement hérité précocément 
aspect "bariolé" (variegated) de ces mouches
Fig 4-46(B)
50
b – Télomères
• Le meilleur modèle : S. cerevisiae
• Pas d'expression de gène à 5000 paires de
nucléotides des extrémités des chromosomes :
structure hétérochromatique
• Intervention d'enroulement et de protéines
• Beaucoup de ces protéines sont connues chez
S. cerevisiae : Silent information regulator
(protéines Sir)
51
Protéines Sir (Silent information
regulator)
• Des mutations dans les protéines Sir
empêchent le silence des gènes proches
des télomères
• Découverte d'un complexe de protéine
Sir lié au télomère qui reconnaît les
queues de certaines histones sousacétylées
52
• Hétérochromatine de
l'extrémité des chromosomes
de levure
H4
H4
Fig 4-47(A)
53
Kimura,A2002p370 Nat
Genet(fig5)
• Model of the role of acetylation of H4–Lys16 in the localization
of silencing proteins along chromosomes. a, Model of the
region-dependent regulation of the interaction between Sir3p
and H4 through the reversible acetylation of H4–Lys16 by
Sas2p and Sir2p. b, Model of the function of the chromosomal
gradient as a boundary to prevent the spread of silencing
proteins. In the wildtype strain (top), the marked increase in
the acetylation of H4–Lys16 from the end of the telomere to the
telomere-proximal region acts as a steep ‘slope’ that Sir3p
(green spheres) must overcome to diffuse throughout the
chromosome. In the absence of Sas2p (middle), acetylation of
H4–Lys16 in the telomere-proximal region is decreased, which
allows Sir3p to diffuse. In the absence of Sir2p (bottom),
deacetylation of H4–Lys16 at the ends of the telomere does not
occur, and Sir3p is not retained in this region.
54
Suka,N2002p378(fig6) Nat Genet 32,(3):Sir2p and Sas2p
opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and
spreading of heterochromatin
55
Sir2 (Silent information regulator 2)
• Désacétylase d'histone  sous acétylation
d'histone propre à l'hétérochromatine 
emballage plus serré des nucléosomes
• Très conservée
56
• Protéines de liaison à l'ADN spécifiques 
fixation d'une protéine Sir (Sir2?) le long
du chromosome  désacétylation des
queues d'histones (par Sir2)  création
de nouveaux sites de fixation de Sir
Fig 4-47(B)
57
• Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine
Fig 4-48(A)
58
• Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine
Fig 4-48(B)
59
Rôle des histones méthyl
transférases
• Méthylent des lysines spécifiques (K9
de H3)
• Lue par les composants
hétérochromatiques 
• Assemblage en hétérochromatine
60
Intérêt des télomères
• Protection des extrémités des
chromosomes
• Régulation de la longueur des
chromosomes
• Ségrégation des chromosomes
pendant la mitose
61
Résumé
• Modifications covalentes des histones
• Transmises
62
c – Centromères
• Séquences d'ADN qui permettent la
ségrégation des chromosomes
• Présence d’hétérochromatine autour des
centromères
• Centromères inclus dans de grandes
étendues d'hétérochromatine où les gènes ne
s'expriment pas (si on en met)
63
Hétérochromatine centrique
(centromérique)
• Histones
– Sous acétylées
– Méthylées
• Autres protéines
• Modèle d'étude : S. cerevisiae
64
S. Cerevisiae
• 125 paires de nucléotides sont
suffisants pour former un centromère
• Plus une douzaine de protéines 
• Un nucléosome spécifique de
centromère
65
•Nucléosome de centromère
chez S. cerevisiae
Variant de histone
H3 (CENP-A) +
H2A + H2B + H4
plus
d'autres
Fig
4-49
protéines
66
• Chromosomes mitotiques de Drosophile
Histone H3
conventionnelle fusionnée
avec GFP ( couleur verte
de H3)
En rouge composant du
kinétochore coloré par un
Fig 4-49 AC spécifique
67
• Chromosomes mitotiques de
Drosophile
Fig 4-49
Histone H3 spécifique du
centromère fusionnée avec GFP
( couleur verte de H3)
+
En rouge composant du
kinétochore coloré par un AC
spécifique
=
Localisation des centromères
en jaune
68
Organismes complexes
• Drosophile, humain
• Centaines de milliers de paires de
nucléotides
• Pas de séquence d'ADN spécifique
• ADN  satellite (petites séquences
d'ADN répétées)
69
• Structure d'un
centromère humain
Fig 4-50
70
Séquences centromériques
• Les mêmes séquences d'ADN  satellite
placées sur d'autres chromosomes ne
forment pas de centromères !!!
• De plus formation du kinétochore ???
• Rôle des protéines > rôle de l'ADN ???
• Formation et maintien de centromère 
Formation et maintien de
hétérochromatine
71
Aspect phylogénétique des
centromères
• Présence d'ADN  satellite non
fonctionnel sur des chromosomes
identique à l'ADN  satellite des
centromères 
• Phénomène de fusion de chromosomes
avec création d'un nouveau centromère
qui devient inactif
• Possibilité de formation de
néocentromères sans ADN  satellite
72
Fig
• Phénomène de
fusion de
4-51(AB)chromosomes
avec création
d'un nouveau
centromère qui
est devenu
inactif
• Chromosome
surnuméraire qui se
crée un centromère
sur de l'ADN non 
satellite
73
• Modèle
d'explication de
la plasticité et de
l'héritabilité des
centromères
Fig 4-51(C)
74
Plasticité des centromères
• Formation de complexes de protéines
de liaison à l'ADN qui ont plus
d'"appétit" pour l'ADN  satellite
• Cette marque pourrait se "perdre" (!!!)
• Avantage évolutif
• Évolution des chromosomes par
cassure-recollement (cf. évolution)
75
d – Défense contre les éléments
mobiles d'ADN
• En résumé
– Hétérochromatine  courtes séquences répétées
d'ADN en tandem (pas de codage de protéines)
– Euchromatine  riche en gènes à copie unique
• Mais
– Il y a des gènes dans l'hétérochromatine
– Il y a des séquences répétées dans l'euchromatine
76
Mutité génique induite par la
répétition du gène
• Si on introduit des séquences répétées
de gènes dans le génome (souris ou
drosophile) 
– Pas d'expression
– Formation d'hétérochromatine
• Si on introduit la séquence unique du
même gène au même endroit 
– Expression du gène
77
Mutité génique induite par la
répétition du gène
• Mécanisme de protection contre l'invasion
par les éléments génétiques mobiles
• Emballage en hétérochromatine et
mutisation des éléments pour éviter leur
prolifération
• Même mécanisme pour l'hétérochromatine
juxta centromérique ?
78
4 - Chromosomes mitotiques
• Stade ultime de condensation
• Seul moment où les chromosomes
sont visibles (exception écouvillon,
polythènes)
• Raccourcissement du chromosome
interphasique de 10 fois
79
4 – Chromosomes mitotiques
• a – Caryotype
• b – Emballage de la chromatine dans le
chromosome mitotique
80
a – Caryotype
81
• Chromosome mitotique typique:
2 chromatides contenant
chacune une molécule d'ADN
identique générée pendant la
phase S du cycle cellulaire
Fig 4-52
82
Fig 4-53
• Extrémité d'un
chromosome
mitotique vue
en microscopie
à balayage :
nombreux
domaines en
boucle après
extraction des
complexes de
riboprotéines
83
Fig 4-54
• Microscopie
électronique d'un
chromosome
mitotique
• Les boucles
émanent d'une
charpente
centrale
• Boucle  gène
(très
grossièrement)
84
Caryotype
• 46 chromosomes
• Marquage longitudinal
85
Caryotype : bandes G
86
Caryotype : bandes G
87
Caryotype spectral
88
Caryotype : un
chromosome
• Bras (p ou q)
• Région (eg : p1)
• Bande (eg : p11)
• Sous-bande (eg :
p11.2)
• Sous-sous-bande
(eg : p11.23)
89
Bandes
• S'observent chez toutes les espèces :
humain, drosophile…
• Très conservées
• Homme  chimpanzé, gorille, orangoutan
90
• Comparaison du plus
grand chromosome
humain (le 1) avec celui
du chimpanzé,du gorille
et de l'orang-outan 
Fig
• Les chromosomes sont
4-57
organisés en très grands
domaines importants
pour leur fonction
91
Corrélation
bande du chromosome métaphasique 
bande du chromosome polythène
• Aucune relation
• Du début de la mitose à la fin les
bandes sont
– De moins en moins nombreuses (elles
fusionnent)
– De plus en plus épaisses
92
Corrélation
bande du chromosome métaphasique 
bande du chromosome polythène
– La bande la plus fine du caryotype contient
plus d'un million de paires de nucléotides
(≈ un génome bactérien)
– Bandes plus ou moins riches en GC (ou AT)
–  à peu près aux bandes des
chromosomes
93
Zones GC riches
–Bandes R
–Forte densité en gène
–Gènes domestiques
–Empaquetage des boucles de
chromatine
–Plus de molécules qui participent
à l'expression des gènes
94
Zones AT riches
• Bandes G
95
b – Emballage de la chromatine
dans le chromosome mitotique
96
• Emballage de la
chromatine
Fig 4-55
97
c - Condensation des
chromosomes en mitose
• Deux conséquences
– Individualisation des chromatides
– Protection des chromosomes
• Nécessité des condensines
98
Condensines
(incluent les SMC)
• Utilisent de l'ATP
• Servent à l'enroulement du
chromosome interphasique
• Gros complexes protéiques qui
contiennent les protéines SMC
(Structural Maintenance of
Chromosomes)
99
Protéines SMC
(sont incluses dans les condensines)
• Composants d'un complexe de condensine
beaucoup plus gros
• Longues molécules dimériques
• avec une charnière centrale
• Domaine globulaire à chaque extrémité
• ADN + SMC + ATP  grandes boucles d'ADN
+ ADP
• Composant important des chromosomes
mitotiques : une molécule tous les 10 000
nucléotides
100
• Protéine SMC
Fig 4-56
101
5 - Organisation des chromosomes
dans le noyau interphasique
• Noyau différent d'un sac à chromosomes
• En interphase semble désordonné
• En mitose très orienté
– Centromère d'un côté
– Télomères de l'autre
• Dans certains noyaux persistance de cette
disposition en interphase : orientation rabl
102
• Racine de plante en
interphase en fluo
– Centromères en vert
– Télomères en rouge
Fig 4-58
103
Polymère en solution
Embryon de drosophile
Fig 4-59
104
Embryon de drosophile
• Division cellulaire toutes les 10 minutes
• Les chromosomes n'ont pas le temps de
quitter l'orientation rabl
• Quand l'interphase est plus longue les
chromosomes ont le temps de se replier
• Ce repliement est lié à des associations
spécifiques à l'intérieur de différentes
régions d'un même chromosome
105
Cellule "commune"
• Les centromères sont dispersés
• Chaque chromosome semble avoir une
position donnée et son petit territoire :
tous les chromosomes ne sont pas
emmêlés les uns dans les autres
106
• Chromosome painting de deux chromosomes
interphasiques de lymphocytes humains
Fig 4-60
Les deux
chromosomes 18
Les deux
chromosomes 19
107
Human chromosomes
18 and 19 interphase
territories. 2D preparations
of nuclei, swollen in
hypotonic and fixed either
with MAA (a-d) or with 4%
pFa (e), were hybridized
with HSA18 and 19 paints.
In the central panels of a-e
HSA18 and 19 paints were
biotinylated and detected
with avidin-FITC (green). In
the left-hand panels of a
and b, paints were labeled
either with biotin and
detected with TR (red) or
with digoxigenin and
detected with FITC (green).
All nuclei were
counterstained with DAPI
(blue). (a) Primary
lymphocytes; (b and e)
lymphoblastoid cell line; (c)
primary fibroblasts; (d)
HT1080 fibrosarcoma cells.
Bars, 2 µm. On the right,
histograms show the mean
proportion of DAPI stain
(blue bars), and HSA18
(filled bars) and HSA19
(open bars) hybridization
signals in each of the five
concentric shells of equal
area eroded from the
periphery (1) to the center
(5) of 50 segmented nuclei.
Error bars show SEM.
Croft,A1999p1119(fig1)
108
Croft,A1999p1119(fig2)
Fig. 2. Subnuclear localization of HSA18 and 19 in
optical sections through 3D-preserved nuclei. Confocal z
series (1 µm) of hybridization to 4% pFa-fixed 3D human
dermal fibroblasts with paints for either HSA18 (a and b)
or HSA19 (c and d), prepared from randomly amplified
total DNA from each chromosome and detected with FITC
(green-yellow) and counterstained with PI (red). Cells
were either untreated (a and c) or treated with DRB (b
and d). Bars, 10 µm.
109
HSA18 and 19 territories
through the cell cycle.
(a) Combined FISH and
immunofluorescence in 4% pFafixed 3D fibroblasts with either
chromosome 18 or 19 paints
(green) and with antibodies
against pKi-67 (red) and B-type
lamin (blue). The cells on the
left are in early stages of G1
and those on the right in mid
G1, S, or G2 based on their
pattern of pKi-67 staining
(Bridger et al., 1998 ). Bar,
5 µm.
(b) FISH for HSA18 or 19 (red)
in flattened preparations of
MAA-fixed lymphoblast nuclei,
pulsed with BrdU (green), and
separated by centrifugal
elutriation. Blue is DAPI. Bar,
2 µm. FACS® analyses of PIstained nuclei from elutriated
fractions chosen to represent
G1, early S, late S, and G2 are
shown beneath each panel.
Horizontal bars on the FACS®
profiles indicate the gating for
cells in G1 (left) and for those
in S and G2 (right).
Croft,A1999p1119(fig3)
110
Dependence of territory
sizes on transcription and
histone deacetylation
(a) Frequency histograms of
the proportion of nuclear
area occupied by
hybridization signals
(detected with FITC) of
HSA18 (filled bars) and
19 (open bars) in 50 swollen
and flattened MAA-fixed
lymphoblastoid nuclei.
(b) Histograms of the
proportion of summed
nuclear area occupied by
hybridization signals
(detected with FITC) of
HSA18 (filled bars) and
19 (open bars) through the
confocal sections of 5-10
fibroblast nuclei fixed with
4% pFa. Vertical solid and
dashed lines show mean
proportionate areas for
HSA18 and 19, respectively.
Cells were either untreated,
or treated with AMD, DRB,
or TSA before harvest. DRBtreated cells were also
grown for 1 h in the absence
of DRB (DRB release).
Croft,A1999p1119(fig4)
111
•
Fig. 5. The orientation of chromosomes 18 and 19 in normal
nuclei and those from a t(18;19). (a and b) Lymphoblast nuclei
cohybridized with paints specific for 18p and q arms (Guan et al.,
1996 ). 18p is in red in a and in green in b. 18q is in the
reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is
blue. (c and d) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints
specific for 19p and q arms (Guan et al., 1996 ). 19p is in red in
c and in green in d. 19q is in the reciprocal color in each case, as
indicated. DAPI counterstain is blue. (e) Flattened primary
lymphocytes hybridized simultaneously with HSA18 paint (red)
and telomeric clones 52M11 and 75F20 (green) specific for
18pter and qter, respectively. DAPI counterstain is blue. (f) 3Dpreserved nuclei cohybridized with HSA18 paint (green) and
telomeric clones 52M11 and 75F20 (red). Red signal in the
cytoplasm is from endogenous biotin. Telomere signals are
apparent with only one of the territories, those associated with
the other territory are in a different focal plane. (g) FISH to a
metaphase spread from an individual with t(18; 19)(p11;p13)
with chromosome 18 material shown in green and 19 in red. The
appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes.
(h and i) Interphase nuclei from t(18;19) cells. HSA18-derived
material is detected in green in h and in red in i. HSA19 is
detected in the reciprocal color in each panel as indicated. As in
g, appropriately colored arrows indicate the derived
chromosomes. A line was drawn from the center to the edge of
the nucleus passing through each derived chromosome. A
second line, perpendicular to the first, was put through the
middle of the signal and it was ascertained which side of this line
the translocated portion was found. (j) Histograms of the
position of the edge of the signal in relation to the edge or the
center of the nucleus, in 50 t(18;19) nuclei, for both the normal
(open bars) and derived (filled bars) chromosomes 18 and
19. There is no significant difference in the positions of derived
and normal chromosomes (P < 0.059 for HSA18 and
P < 0.110 for HSA19).
Croft,A1999p1119(fig5)
112
Associations of HSA18 and
19 with nuclear
substructure.
Lymphoblastoid nuclei
extracted with
0.5, 1.0, 1.2, and 1.8 M
NaCl, fixed with MAA, and
hybridized with alternately
labeled chromosome
18 and 19 paints, the color
of which is indicated at the
right of each panel. DNA
was stained with DAPI
(shown in blue on the right
and in black and white on
the left). Chromosome
19 material is retained
within the residual nucleus.
HSA18 is released into the
DNA halo at high salt
concentrations. Bar, 2 µm.
Croft,A1999p1119(fig6)
113
Schémas hypothétiques
d'organisation des
chromosomes dans le noyau
1. Fixation du chromosome à
l'enveloppe nucléaire
2. Existence d'un "nucléosquelette"
114
1 - Fixation du chromosome à
l'enveloppe nucléaire
• Par leurs télomère par exemple
• Toutefois position non fixe dans le
noyau
115
Fig
• Noyaux
d'embryons de
drosophile :
localisations de
deux régions
différentes (jaune
et magenta) du
chromosome 2
proches de
l'enveloppe
4-61
nucléaire (AC
antilamina en
vert)
116
2 - Existence
d'un"nucléosquelette" (1de2)
• "Matrice" nucléaire
• "Charpente nucléaire" (ce qui reste
après extraction)
• Certaines des protéines peuvent se
lier à des séquences spécifiques de
l'ADN appelées SARs (Scaffold
Associated Regions)ou MARs
(Matrix Associated Regions)…
117
2 - Existence
d'un"nucléosquelette" (2de2)
• …Formeraient la base des boucles
• Existence in vivo ?
• Organisation des chromosomes  localisation
des gènes  expression des gènes
118