Why gene cloning and DNA analysis are important

Chapter1. 유전자 클로닝과 DNA 분석의 중요성

Gregor Mendel ; 생물학적인 특성들의 유전을 설명하기 위해 일련의 규칙을 체계화 유전자 (gene) ; 한 유기체의 각 유전 가능한 성질을 가진 인자 유전학의 발전 1903년, W. Sutton ; 유전자가 염색체(chromosome)에 존재 1910년, T.H. Morgan ; 유전자 지도라는 기술을 개발, 초파리에는 4개의 염색체가 있으며 거기에는 2000개 이상의 유전자들이 존재 1952~1966년 ; DNA구조가 규명 유전 암호 (genetic code) 전사 (transcription) 번역 (translation) 1971년 ; DNA 재조합 기술, 유전공학 유전자 클로닝 (gene cloning) ; DNA 염기서열 분석 기술 유전자 조절에 대한 연구 생명공학 1985년, Kary Mullis ; 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)발명 생체분자 고고학 DNA 법의학

유전자 클로닝 클로닝; 재조합 DNA 분자를 생산 벡터; 운반체 콜로니 또는 클론; 동일한 숙주세포의 군락

The basic steps in the polymerase chain reaction.

1. 94 o C ; 수소 결합을 끊음, Denaturation 2. 50~60 o C ; DNA 분자 재결합, Annealing, Primers에 의한 결합 방지 3. 72~74 o C ; DNA 분자 합성, Synthesis, Taq DNA polymerase PCR ; 변성 --- 결합 --- 합성 25cycles 5백만개의 새로운 이중가닥 DNA 분자 생성

Chapter2. Vehicles for gene cloning Plasmids and Bacteriophages

• 클로닝 운반체 ; 1. 숙주세포 내에서 복제가 가능 2. 딸세포에 이전 3. 크기가 작아야함. (10Kb 이하) 4. Plasmid 5. Bacteriophage

• 플라스미드의 기본적인 특징 1. 원형 DNA 분자 2. 박테리아 세포내의 독립적인 유전요소 ; 하나 혹은 그 이상의 유전자 3. 항생제에 저항하는 유전자 – 선별표식자 (selectable marker) 4. 복제 시작점 (origin of replication) ; 적어도 하나는 존재

플라스미드의 복제 • 비삽입 플라스미드 ; 1. Non-integrative plasmid 2. 박테리아 염색체와는 무관하게 세포 내에서 복제가능 3. DNA 복제효소를 이용 • 삽입 플라스미드; 1. Integrative plasmid or 2. Episome 3. 박테리아 염색체내에 삽입하여 세포 내에서 복제 4. 수 많은 세포분열 후에도 삽입된 상태로 유지가 되지만, 어떤 단계에서는 독립적인 요소로 존재

• 크기 및 복제수 (size and copy number) - 10 kb 이하 - High copy

• 접합과 조합성 - Conjugative plasmid - 성접합을 촉진 - tra 유전자에 의해 조절 - 대장균 (E.coli); 7 가지 plasmids -Non-conjugative plasmid • Plasmid classification - F plasmid; 생식능 - R plasmid; 항균성제 - Col plasmid; 살균성, colicin - Degradative plasmid; 신진대사, 톨루엔 - Virulence plasmid; 질병유발 (crown gall)

Bacteriophages

- 박테리아를 감염시키는 바이러스 - DNA 혹은 RNA 분자 - Capsid 혹은 보호벽으로 둘러싸여 있음

• 용균성 파아지 (lytic phage) - 감염주기 ; 20분 이내 - 박테리아 세포의 용해 (lysis) • 파아지 DNA 복제 - 불안정 - Capsid 단백질이 합성

• 용원성 파아지 (Lysogenic phage) - Lambda (  ) phage - 파아지 DNA가 박테리아 유전체 (genome) 속으로 삽입 ;prophage

• 용원성 파아지 (Lysogenic phage) - M13 phage - 박테리아 genome 속으로 삽입되지 않음 - 세포가 용해되지 않음

•  DNA 분자의 유전자 조직 - Head-and-tail - 49kb

• 선형과 원형  DNA (a) 선형  DNA 분자 - 12개의 상보적인 염기서열 - Sticky ends - Cohesive ends - Cos site - 원형  DNA 분자를 형성 (b) - 박테리아 genome에 삽입 - Rolling circle 복제 기작 (c) - Endonuclease에 의해 cos site를 절단 - Packaging - 15개의 다른 단백질이 필요

• M13 – filamentous phage - 원형 단일 사슬 DNA 분자 - 6407 bp - 3개의 다른 단백질이 필요 • 감염 경로 - Pilus를 통해 세포 내로 주입 - 이중가닥 형성 (RF) - 100개 이상의 copies - Rolling circle mechanism • - 단일 가닥 DNA 분자 형성 - 원형 단일 사슬 DNA 분자 장점 - DNA sequencing -

in vitro

mutagenesis • • 포유류 바이러스 - Simian virus 40 - Adenovirus - Retrovirus 곤충 바이러스 - Baculovirus