Transcript 滴定分析法
第三节 常用定量分析方法及其运用 药学0201 王欢欢 3021901012 生化药物、基因工程药物常用定量分析方法 理化分析法 化学分析法 电化学分析法 光谱分析法 色谱法 生化测定法 酶法 电泳法 生物检定法 化学分析法 重量法 根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定 所含成分的含量 根据被测组分分离方法分类： 提取法 胰酶中脂肪含量的测定 挥发法 炽灼残渣 干燥失重 沉淀法 沉淀反应 滴定分析法 根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生 酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定 电化学分析法 离子选择性电极 药物电极 药物膜电极 生物组织膜电极 微生物电极 免疫电极 免疫场效应管 酶电极 酶催化反应 生成产物不 同，电极种 类不同 其他：极谱氧电极法 微电流电位法 生物传感器技术 光谱分析法 比色法 蛋白质 双缩脲反应 硫酸软骨素 Elson-Morgan比色法 按干燥品计算，测定氨基己糖含量 原理：酸性条件下水解 氨基己糖 碱性条件下与乙酰丙酮反应 再与二甲氨基苯甲醛反应 氨基葡萄糖（红色） 以盐酸葡萄糖溶液为对照，525nm测定A 计算: 氨基己糖的含量= A×Ws×0.8309×500 As×W ×100％ 式中 A—供试品溶液吸收度平均值 As—对照品溶液吸收度平均值 Ws—对照品溶液每1ml中含盐酸氨基葡萄 糖的量（mg） 0.8309—校正因数（氨基葡萄糖与盐酸氨 基葡萄糖分子量的比值） 紫外分光光度法 蛋白质 280nm 糜蛋白酶与底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯 作用后产物 237nm 荧光分光光度法 反应物或反应激发产生荧光直接测定 应用荧光试剂的荧光测定 应用另一酶的催化反应的荧光测定 酶法 酶活力测定法 酶分析法 以酶为分析对象 以酶为分析工具或试剂 活力单位 比活性 酶以外其它物质的含量 共同点： 以酶能专一而高效地催化某些反应为基础，通 过对酶反应或生成物等浓度的测定而检测相应 物质的含量 酶活力测定法 基本概念 酶活力 酶催化一定化学反应的能力 活性单位（国际单位，IU） 任何一种酶，在25℃ 以最适当的底物浓度、 最适当的缓冲离子强度以及最适当的pH等 条件下，每分钟能转化一微摩尔底物的酶量 比活性 每一毫克蛋白质所含酶的单位数 分子活力 每微摩尔酶对最适底物的活性单位 每个酶分子每分钟转化底物的分子量 测定方法 物理法 化学法 酶分析法 终点法 动力学法（取样测定法） 反应速率法（连续测定法） 取样测定法 中止酶反应 酶变性剂 5%三氯醋酸 3%高氯酸 酸 碱 醇 连续测定法 在反应过程中对反应系统进行连续检测 准确性和测定效率都较取样法更好 检测方法 紫外－可见分光光度法 氧化还原酶 脱氢辅酶NAD(P)H 340nm 细胞色素氧化酶底物细胞色素C 550nm 摩尔吸收系数 2.18×104 氧化型 0.80×104 荧光分光光度法 底物本身在酶反应过程中有荧光变化 利用具有荧光底物 旋光度法 酶偶联测定法 其他 电化学测定法 离子选择性电极测定法 放射化学法 举例 胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨 酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键，酰 氨键及酯键 供试品溶液的配制 精密称取本品适量 0.001mol/L盐酸溶液溶解 制成50-60IU/ml胰蛋白酶溶液 底物溶液的配制 BAEE盐酸盐85.7mg 加水溶解使成100ml 精密量取10ml 磷酸缓冲液稀释成100ml 25.0± 0.5 ℃,253nm以水做空白，测定 吸光度 A应在0.575－0.585之间为宜 测定 空白： 底物溶液3.0ml＋0.001mol/L盐酸液0.2ml 供试品溶液 0.2ml与底物溶液3.0ml 立即计时并摇匀 253nm测定吸收度 每隔30s测一次，共5min 以A为纵坐标，时间为横坐标作图 每30s吸收度改变恒定在0.015－0.018之间， 呈线性关系不少于3min 计算 A1-A2 P= 0.003TW 式中P－每1mg胰蛋白酶供试液中含胰蛋白酶 单位数 A1－直线上终止的吸收度 A2－直线上开始的吸收度 T－A1至A2读数的时间（min） W－测定液中含供试品的mg数 0.003－上述条件下，吸收度每改变 0.003， 相当于1个胰蛋白酶单位 影响效价测定的因素 酶浓度 最佳浓度 50IU/ml－60IU/ml 温度 温度每升高1 ℃ 活力单位增高5% 底物 底物溶液应在配制后3h内使用 关键在于判断底物浓度[S]与Km的关系 pH值 H+能改变酶活性中心的解离状况， 升高或降低酶的活性 空白和对照实验 酶反应进程曲线和酶浓度曲线 6 0.6 5 0.5 0.4 反应速度 产物 4 3 0.3 2 0.2 1 0.1 0 0 0 5 10 反应时间(min) 15 0 20 40 酶量 60 酶分析法 动力学分析法 酶的底物 当底物浓度[S]<Km时，一级反应性态 辅酶 双底物反应 一类底物浓度足够高 单底物反应 活化剂 注意：浓度超过一定水平后导致抑制 测定不专一，易受干扰 抑制剂 不可逆抑制剂 浓度 抑制程度 线性 可逆抑制剂 低浓度范围 浓度 抑制程度 举例 抑肽酶的效价测定 底物溶液的制备 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐171.3mg 加水溶解并稀释至25ml 胰蛋白酶溶液的制备 胰蛋白酶对照品适量，精密称定 加盐酸滴定液（0.001 mol/L）制成每1ml 中约含0.8单位溶液（约每1ml中含1mg） 的溶液 胰蛋白酶稀释溶液的制备 精密量取上述胰蛋白酶溶液1ml 用硼砂-氯化钙缓冲液（pH8.0）稀释成20ml 室温放置10分钟，置冰浴中 供试品溶液的制备 精密称取本品适量 加硼砂-氯化钙缓冲液制成每1ml中约含1.67单 位（约每1ml中含0.6mg）的溶液 精密量取0.5ml与胰蛋白酶溶液2ml 再用硼砂-氯化钙缓冲液（pH8.0）稀释成20ml 反应10分钟，置冰浴中（2小时内使用） 测定 供试品 硼砂-氯化钙缓冲液9.0ml＋底物溶液1.0ml 25℃±0.5℃水浴3～5分钟 滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节pH8.0 精密加入供试品溶液1ml 用1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液滴定 使溶液的pH值始终维持在7.9～8.1 每隔60秒读取pH值恰为8.0 时所消耗的氢氧化 钠滴定液的容积（ml），共6分钟 对照品 精密量取胰蛋白酶稀释液1ml，按上法操作 计算 每1mg 抑肽酶的效价＝ 式中 4000为系数 (2n1－n2)×4000×f Ｗ Ｗ为抑肽酶制成每1ml中约含1.67单位时的酶量 n1为对照测定时每秒消耗的NaOH滴定液容积 n2为供试品溶液每秒消耗NaOH滴定液容积 2为供试品溶液中所加入胰蛋白酶的量为对照 测定时的2倍 f 为氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）校正因子 总变量分析法 又称平衡法或终点法 重要条件： 被测底物浓度小，控制反应于一级反应 水平 双底物反应一底物应具有足够高的浓度 酶的用量高，以保证反应较快达到终点 酶用量，工具酶一般1Km－2Km左右 谢谢大家！