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第四小單元
繁殖技術
•壹.人工受精
• 一.歷史:
•
1.古代發明時期:14世紀-1914年。
•
2.近代發明時期:1914-1945年。
•
3.組織化和推廣時期:1945年-現在。
•4.說明:
• A.紀元800年
•
西西利亞人已認識人工受精。
• B.1322年
•
阿拉伯人從公馬採精配上母馬，S.
•
Wammerd在1980年重複試驗成功。
• C.17世紀:
•
(1)義大利已將綿羊的人工受精實際化。
•
(2)Ham和Leunwen hoek 在尿液內發現精子。
• D.1785-1789年
•
義大利Spallangani發現精液的冷卻與稀釋。
•E.19世紀:
• Bar和Graaf說明卵子與精子的結合作用。
•F.20世紀:
• a.1914年-狗之假陰道。
• b.1924年-牛之假陰道。
• c.1931年-牛之假母台。
• d.1931年Milowanow首先成立人工受精中心，
•
之後丹麥、瑞典、芬蘭、義大利、德國、
•
美國、日本陸續成立人工受精中心。
• e.二次大戰時，人工受精工作全部癱瘓，戰後
•
以美國發展最快。
• G.目前各國使用人工受精的現況:
國別
美 國
丹 麥
日 本
英 國
以色列
蘇 聯
西 德
普及率%
45
100
98
65
65
40
40
•H.臺灣:
• (1)原於各試驗所、農會及防治中心等
•
機構設立人工受精站。
• (2)技術轉移。
• (3)目前普及率在95%以上。
•二.乳牛實施人工受精的優缺點:
• 1.優點:(1)可增加優良公牛的使用率。
•
(2)一般乳牛場不需飼養公牛。
•
(3)一頭公牛的能力可迅速及有效的予
•
以判定。
•
(4)可防止疾病的傳播如弧菌病、毛滴
•
虫病、鉤端螺旋體病、流產病、結
•
核病等。
•
(5)公牛不能或不願時。
•
(6)可免除移動公牛的煩累。
• (7)可提高受胎率:
•
a.精液的品質佳。
•
b.母牛不便或性情不好時。
•
c.可把精子直接注入子宮內。
•
d.可行多次配種。
•2.缺點:
• (1)需特別的技術人員及設備。
• (2)觀察母牛發情麻煩，且準確度不高而不能
•
適期配種。
• (3)花費太多時間與勞力。
•
•三.公牛的精液處理
• 1.公牛精液處理的過程:
•
•
採精
精液檢查
稀釋
•
•
馬上使用
冷藏
冷凍
•2.公牛採精
• A.方法:(1)假陰道法
•
(2)電刺激法
•
(3)按摩法
•
(4)真陰道法
• B.最常用者為:假陰道法
• C.採精的設備:(1)假陰道如:P52
• a.有入水口的圓筒 b.外層橡皮套:長30-40cm
• 直徑5-6.7cm c.內層橡皮套d.漏斗狀的橡皮套
•
(2)精液收集管
•
(3)護欄
•D.採精過程:
• 裝配假陰道
•
• 假陰道內注入60℃
• 的溫水，水量為筒
• 直立時，離上端1-2
• 吋處
• 開口端塗上潤滑膠
•
引公牛上假母臺
引導公牛陰莖入假陰
道中
等待公牛射精
收集精液
完
成
•E.注意事項:
• (1)工作人員應隨時注意自身的安全。
• (2)工作人員採精時不可直接握住或碰觸公牛的
•
陰莖。
• (3)收集精液時假陰道的角度應為45度。
• (4)收集的精液應避免日光的照射，且應避免溫
•
度劇烈變化。
• (5)應作詳細的記錄。
•3.精液檢查
• A.肉眼檢查:
• (1)精液量:年輕公牛約2-5ml，年齡大的公牛
•
約6-18ml，平均8ml。
•
(2)顏色:正常為白色或乳白色，若是琥珀色
•
可能是含有尿液，若是赤色或淡桃
•
紅色可能是混入血液，若是綠色可
•
能是含有膿液。
•
(3)雲狀形成:濃度高、活力大者明顯，反之
•
則不明顯。
•
• (4)臭味:具有特殊的味道，若是混入尿液則有
•
尿臭，若是保存不良或長期保存則可
•
能有腐敗臭。
• (5)PH值:6.9-7.5 。
•B.顯微鏡檢查
• (1)濃度:a.方法:有計數法及比色法
•
b.操作步驟 :
•精液稀釋
以吸管吸至
吸3-4%的食鹽
• 100倍
刻度 1
水至刻度101
•
•搖晃30秒
吹掉前3-5滴
滴樣品至計數盤
• 計算
先用100倍後調
置入顯微鏡下
•
至 400-1000倍
• c.精蟲數計算公式:
•計算出之總精虫數×10×100×1000＝總精虫數
•
(每ml精液)
• d.總精虫數的計算方法:如下圖
•
• 有效
無效
•
•e.注意事項:
• 1.注意吸取時的準確度。
• 2.若有失誤，必需重新清洗吸管再重新操作。
• 3.樣品應滴在蓋玻片邊緣使自動滲進計算格內
• 4.精液應維持在35℃左右。
• 5.亦可使用比色法或Coulter 計算器(Iversen
• ，1964) 。
•
•
•(2)精子活力檢查:
• a.操作步驟:
•準備精液 白金耳消毒
•
燒紅並冷卻
•活力判定
•
以100倍觀察
以白金耳取精液樣
品置於蓋玻片上
把蓋玻片覆蓋於
凹形載玻片上
•b.活力判定:
•
第一級 精子完全靜止。
•
第二級 精子幾乎停止運動，但在原處左
•
右擺動或旋轉。
•
第三級 精子呈緩慢之運動。
•
第四級 呈快速之運動，且有大部分是直線
•
運動。
•
第五級 呈快速之運動，且有大部分是環形
•
運動，視野內會呈現多重漩渦。
•
•c.注意事項:
• 1.準備精液時量不可太少。
• 2.此法稱為懸滴法。
• 3.冬天溫度低時，顯微鏡需加裝加熱器，調節
•
溫度至38℃。
• 4.3級以上的精液才可使用。
• 5.避免使用酒精及消毒劑。
• 6.樣品使用前需稍為搖晃。
•
•
•(3)精子存活率:70%以上。
•(4)精子畸形率:
• a.操作方法:
•準備精液 以甲醇或福馬林
位相差顯微鏡
•
一小滴固定精子
600-800倍檢查
•
• b.畸形判定:頭帽損傷、不成熟、斷尾、尾巴
•
彎曲等。
• C.畸形率:不超過20-30% 。
•4.精液稀釋
•A.目的:(1)擴大容積。
•
(2)提供營養。
•
(3)增加可配種母牛的頭數。
•
(4)製作冷凍精液。
•B.稀釋倍數:1:10 1:40
•C.有效精子數:0.1-0.5億。
•D.稀釋液的種類與製備:
• (1)卵黃+檸檬酸鈉稀釋液:
•
a.卵黃中含有葡萄糖，可抑制精液中的果
•
糖分解，可提供精子營養，可避免精子
•b.製備:
•
1.以2.9公克檸檬酸鈉加二次蒸餾之蒸餾
•
水，溶成100ml 。
•
2.雞蛋洗淨，消毒，乾燥，取出蛋黃。
•
3.以蛋黃20ml+檸檬酸鈉液80ml混合即可
•
(最高可至1:1)
•
4.每ml稀釋液可加入1000IU的
penicillin
•
and 1000ug鏈黴素。
•c.亦可利用磷酸及枸緣酸鈉代替。
•d.此稀釋液為Salisbury等(1941)所發展。
•(2)牛乳稀釋液
• a.精子對牛乳具有親合性。
• b.使用牛乳稀釋液的受精率比蛋黃高。
• c.牛乳中含有乳素需先加熱破壞(77-79℃隔水
•
加熱10分鐘) 。
• d.製備:1.選取新鮮消毒過且已均質的脫脂乳。
•
2.加熱。
•
3.加入蛋黃10%、甘油3%共100% 。
•
4.加入適量的抗生素。
•
5.此稀釋液由Thacker及Almquist
•
(1948)所發展。
•E.稀釋過程:
• a.稀釋液加溫至與精液相等(35℃) 。
• b.預稀(1:5) 。
• c.稀釋。
• d.稀釋液倒入時應沿管壁緩慢加入。
•5.精液保存
• A.降溫:5℃/20分鐘至5℃ 。
• B.保存時間:5-7日 。
•6.精液冷凍:
• A.安瓶式:採精
•
•
平衡
• 5℃中8小時
•
• 精液稀釋
• 加入甘油
冷卻
5 ℃/20m
精液分裝
降溫0-20℃
3℃/分
-20至-50℃
3-5℃/分
•
•
置入液態
氮中保存
-50至-79℃
急速下降
精液檢查
精液稀釋
• B.藥丸型:
•
採精
•
• 直接滴在
•
乾冰上
•
• 置入液態
• 氮中保存
置入液態氮中保存
精液檢查
精液稀釋
平衡 5℃
中8小時
冷卻
5 ℃/20m
• C.膠囊型:
•
採精
精液檢查
•
• 置入已放置在
平衡 5℃
• 乾冰上的膠囊
中8小時
•
• 置入液態
• 氮中保存
精液稀釋2-3倍
冷卻
5 ℃/20m
置入液態氮中保存
•
•
註1:配種時以一膠囊加溶解液0.9ml行之，但
亦可直接注入子宮內。
• 註2:溶解液的配方
•
A.:38-40℃的滅菌牛乳
•
B.38-40℃的3%枸緣酸鈉
•
C.1.3%重碳酸鈉16ml
•
+
•
5%葡萄糖64ml
•
+
•
蛋黃20 ml
•D.麥管型冷凍精液:
•
採精
精液檢查
•
•
平衡
冷卻
• 5℃中8小時
5 ℃/20m
•
• 精液稀釋
置入1ml
•
加入甘油
的麥管中
降溫0-20℃
3℃/分
•
•
-20至-50℃
3-5℃/分
置入液態
氮中保存
-50至-79℃
急速下降
精液稀釋
精液分裝
7.精子鐳射分離技術
•A.歷史:1.1920年代剛研發A.I時，就有學者強調
•
如何授精，可生產較多的公或母仔畜
•
的想法及做法。
•
2.1960證實只靠A.I無法達到此目標。
•
3.1976年B.L.Gledhill教授引用鐳射技
•
術，證實哺乳動物精子的DNA含量有差
•
異(如表一及表二) ，而使得分離X精
•
子與Y精子變成可行。
荷蘭牛
安格斯牛
馬
豬
老鼠
兔
人
•
表一
3.8%
3.8%
4.1%
3.6%
3.2%
3.0%
2.8%
X精子的DNA含量比Y精子的DNA含量多多少
表二 哺乳動物生殖生物學的基礎數據
性比率為50:50
X染色體比Y染色體大一些
X染色體的DNA含量較多
DNA含量的差異謹存在於X與Y染色體
X與Y染色體的DNA含量相差2.8-7.5%
•B.X與Y精子分離技術
•1.定止的精子(Immobilized sperm)之自然沉澱:
• 沉澱愈深的精子用來授精會有70%是母的。
•2.脫脂奶粉稀釋液，甘油冷凍稀釋液:取上層液
• 的精子來授精會增加生公的數目。
•3.白蛋白(Albumin)柱層分析 :牛精液冷凍前先
• 經柱層分析，再進行冷凍會有很好的解凍存活
• 率。
•4.沉澱速率法:依精子的大小、密度和形態來定
• 出其沉澱率。
精子的大小是此種分離技術的要件，而形態是
• 一項非主要的要素。精子的頭是非球狀的。
•5.梯度離心法:透過不同濃度的液體所組成的梯
•
度，可讓不同沉澱速率的精子分。液體的
•
密度是比精子還低。梯度離心法較沉澱速
•
率法所需要的時間更少，但分離的效率是
•
樣的，且兩者均不夠精準。
•6.活動力(Motility)與電泳分離法:當不動的精
•
子(Immotile sperm)在中性液被電泳時而
•
吸向陽極，反之會動的精子被吸向陰極。
•
尤其精子的頭泳向陰極，尾巴指向陽極，
•
表示精子尾巴內在的負電位大於電泳的電
•
位差。
•7.等電位焦距法(Isoelectric focusing):使用
•
梯度柱層分析讓精子自上而下，並以電泳
•
來使之達到等電位的狀態。
•8.H-Y 抗原:精子以H-Y抗體來中和，進而授精，
•
可讓小鼠(Mouse)生下的子代中45.4%是公
•
的，而一般是53%的子代是公的。
•9.樹酯柱層分析:X精子透過樹酯柱層後會集中在
•
一塊，其中一些流出液會有65~85%的X精
•
子。
•精子鐳射分離
•原理：1.以一種非致死性的螢光染色劑來和精核
•
內DNA結合。
•
2.再使該精子一個個通過鐳射光，此時
•
因鐳射光的激發，致使精子內的螢光染
•
色劑放出螢光。由於X精子的螢光量會
•
多於Y精子的螢光量，經由螢光感應板
•
計量後，可緊接著驅動放電板，來使X
•
精子帶正電，使Y精子帶負電。
•3.當這些被加附正電的X精子或負電的Y精子通過
• 一個有正電板在左和負電板在右的吸電板區，
• 會因正負電相吸作用，而使精子偏離中心線，
• X精子落入右側收集管，而Y精子則落入左側收
• 集管。
•10.依DNA含量的流速分離(Flow sorting):可藉
•
由X精子的DNA多於Y精子的DNA之原理，很
•
精準地把95%以上的X精子與Y精子分開。
•
已有每秒流速達一萬個精子的鐳射分離儀
•
在美上市。
•4.新的螢光染色劑SYBR-14(1995)僅染活的精子
且在可見光波488nm被激發，其對精子之傷害幾
近沒有。
•5.1996年開發螢光染色劑Dansy lysine可用來全
染精子細胞膜，再藉助縫隙掃描式新機型來事先
檢測精子頭、頸和尾部分，因此，可把捲尾的畸
型精子區分出，並解決了精子通過鐳射光是頭在
前或尾在前的秒差困擾，大大地提高分離X精子
和Y精子的準確率至98%，同時確保收集管中的精
子是型態完整的活精子。
•
使用精子鐳射技術的優點
•1.加速遺傳改進速率
•2.增加管理彈性
•3.提昇生產效率並降低生產成本
•4.減低環境致因的風險和種用頭數
•8.A.I
•A.方法:(1)陰道開張法(少用)
•(2)直腸固定法(常用)
•B.步驟
•精液解凍 36
℃-1分鐘
•清洗外陰
部
•麥管減
去一端
•置入受
精器中
•清除直腸
中的糞便
•戴上手
套
•擦乾外陰部
•緩慢注入精
液
•緩慢抽出
受精器
•手持人工受
精器向上30
度插入陰道
•引導受精器通
過3 道子宮頸
皺摺
•按摩子宮
頸及外陰部
•另一手伸入
直腸固定子宮
頸
•受精器插入
20公分後 水
平
•記錄母牛
及精液的編
號
貳.牛之胚胎移置
•一.歷史:
•1.牛胚移置技術自1949年Horvey氏發表一篇狂傲
• 文章「你的最好乳牛一年可以生產30隻小牛」
• 後，ㄧ直到1969年才開始逐漸的發展。
•2.此技術在美國及歐洲已商業化應用。
•3.臺灣亦有此技術，但推廣不成功。
•4.此技術可應用在不同種類的動物，或不同生產
• 用途之動物，如駱駝的胚成功的移置於牛子宮
• 中，或可由肉母牛生產乳牛等。
• 二.牛胚移置技術的主要過程:
• 1.建立供胚牛群
• 2.建立受胚牛群
• 3.供胚牛OVA及發情同期化
• 4.A.I
• 5.洗胚
• 6.鑑胚
• 7.移置
•三.此技術需特別注意牛隻的管理及人員的訓
練
• 四.供胚牛之管理與飼養
• 1.供胚牛之選擇:
•
A.要有優良的遺傳基因:
•
a.查閱族譜
•
b.記錄本身之生產能力
•
c.測定其子代之性能
•
B.要有優良的繁殖能力:
•
a.發情時間是否正常
•
b.發情週期是否正常
•
c.分娩是否正常
•
d.子代之公母比例
• C.後裔之市場價值:
•
a.主要用為牛群數量之參考
• D.要有優良的健康狀況
•2.供胚牛之飼養:
• a.過肥或營養不良皆不宜
• b.應隨時注意調整其體重
•3.供胚牛發情週期之建立:
• a.需正確與詳細的記錄
• b.至少需有二次正常的發情週期，才可用為供
•
胚牛
• c.記錄過程若受干擾，需重新記錄
• 五.受胚牛之管理與飼養
• 1.受胚牛之選擇:
•
A.品質標準:
•
a.年輕且無疾病
•
b.需經証明有孕育及做母親的能力
•
c.母性需良好
•
B.經濟價值:
•
a.量
•
b.產次
•
c.產歷
•
C.健康:同供胚牛
•2.發情資料建立
• A.需作好完善的發情觀察與記錄
• B.供胚牛與受胚牛之發情間距，不超過24小時
•
或受胚牛應比供胚牛較早發情
•3.識別:需建立完善且顯著的識別系統
•4.餵飼:
• A.成熟母牛以保持健康及不超重為原則
• B.年輕母牛保持每天增加1.5-2lb的體重為原
•
則
•5.設備:需有圍欄及檢疫設備
•6.牛群數量之保持:
• A.需根據本場之改良狀況來決定
• B.需根據本身的飼養能力及子牛的銷售狀況來
•
決定
•六.母牛之超級排卵與發情同期化
• 1.OVA:
• a.原理:在母牛接近排卵期時，利用H.處理使
•
母牛的排卵數增加至6-8個
• b.方法:在供胚母牛穩定發情後的第10，11，
•
12及13天，連續4天給予注設Fsh及LH
•
，上下午各一次
• 2.發情同期化:
• a.原理:在有黃體的母牛，給予施打前列腺素
•
該母牛應在48-96小時後發情，一般
•
為72小時
•b.方法:
•Ⅰ.在供胚母牛穩定發情後的第12天，以觸診檢
• 出有黃體的受胚牛
•Ⅱ.檢出之受胚牛給予注射前列腺素，上午25mg，
• 下午15mg
•Ⅲ.供胚牛則在第13天時，給予注射前列腺素，
• 上午25mg，下午15mg
•Ⅳ.受胚牛及供胚牛應在第15天時開始出現發情
• 且受胚牛應會比供胚牛早一天發情
•Ⅴ.為何受胚牛要比供胚牛早一天發情?
•七.配種:
• 1.供胚牛於穩定發情後之12及24小時各配種一
•
次
• 2.每次配種各用2劑量的精液
•八.胚的收集:
• 1.胚的收集時機:
•
A.胚在牛體內的發育:
•時間
•1-3天
•4-8天
128
•9-19天
位置
輸卵管
子宮角
子宮角
細胞數
2-32
32孵化的
• B.收集時機:
• a.一般在配種後的第6-8天
• C.WHY ?
• a.1-5天的胚仍停留在輸卵管及子宮角前端，
•
收集不易
• b.9天以後的胚已孵化，易受傷害
• c.9天以後的胚，若要進行冷凍保存或胚分割
•
則成功率低
• d.避免胚胎停留在OVA母牛的體內太久，因擔
•
心其H.的變化會影響胎兒的發育
• e.目前的設備大都是配合6-8天取胚時所設計
•2.收集方法:
• A.外科手術法:(少用)
• B.非外科手術法:(常用)其步驟如下:
•
•配製沖洗液
•固定牛隻
•以特製的沖洗管
•依A.I的方式置入
•子宮角中(如圖
一)
•回收沖洗液
•開始沖洗
•九.鑑胚
• 1.約有80-100%的胚可回收
• 2.回收之胚置於解剖顯微鏡下檢查是否正常
• 3.正常的胚以吸管吸出，然後置於培養液中
• 4.沖洗前應檢查黃體數，以確認胚是否完全
•
洗出
•十.胚移置:
• 1.外科手術法:(如圖)
• 2.以特殊之移置器，以類似A.I的方式將胚置
•
入受胚牛的子宮角中，如圖(5)
• 十.結論:
• 1.牛胚移置技術在很多國家已經商業化，此技
• 術實在是一個改良生產力及縮短世代間距的
• 好方法，唯需有較高的技術與較複雜的設備
• 2.臺灣亦作過推廣，但無成效，其原因可能是:
• A.臺灣的氣候使具高生產力的牛隻無法發揮
•
導致牛群的生產能力皆相近，無使用此技
•
術的價值
• B.農民的技術及觀念不足
• C.農民所飼養的牛隻頭數太少
參.牛胚分割
•一.目的:可增加胚的利用
•二.操作步驟:(如圖一)
• 1.切斷未受精卵之透明帶
• 2.以微吸管(pipette)吸出內容物
• 3.留下空透明帶
• 4.右邊吸管固定住胚，左邊切割刀由中線將胚
•
分割為兩部分
• 5.一半的分割胚
• 6.以微吸管吸取一半胚內容物
• 7.剩餘之半胚
• 8.將吸取之半胚移置入空透明帶中
•三.討論
• 1.胚分割會傷害部份細胞，因此其懷孕率只有
• 55%
• 2.胚分割亦可操作為一變三或一變四，但其成
• 功率仍太低
肆.胚的冷凍保存
肆.胚的冷凍保存
• 洗胚
•以0.5℃/分的
•降溫速率降溫
•鑑胚
•-30℃
•添加冷凍保護劑
•以1℃/分的降 •-33℃
•-6℃ •溫速率降溫
•維持5-10分鐘使植冰
•-6℃
•37 ℃水溶法直接解凍
•以0.3℃/分的
•降溫速率降溫
•移入液態氮
•長期保存