Transcript 维生素D 2
第九章 维生素类药物的分析 维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的 微量营养物质。 人体不能合成维生素。 分类： 脂溶性 VitA、D2、D3、 E、K1 等 水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、泛酸 第一节 维生素A的分析 全反式 R: -H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯 一、 结构与性质 （一）为一个具有共轭多烯侧链的环己烯 1. 具有UV吸收 2.存在多种立体异构化合物 max 维生素A 325.5 新维生素Aa 328 相对生物效价 顺反异构 100% 全反式 75% 2－顺 新维生素Ab 320.5 24% 4－顺 新维生素Ac 310.5 15% 2，4－顺 异维生素Aa 323 21% 异维生素Ab 324 24% 6－顺 2，6－顺 3.易发生脱氢、脱水、聚合反应 VitA2 VitA3 鲸醇 （二） 共轭多烯侧链 易被氧化 紫外线、O 2、氧化剂 VitA VitA 醛 环氧化物 VitA 酸 [O ] △或有金属离子存在时氧化↑ 环氧化物 VitA醛 VitA酸 （三） 与三氯化锑发生呈色反应 SbCl 3 VitA 蓝色 紫红 CHCl3 （四） 溶解性 不溶于水 易溶于有机溶剂和植物油等 鉴别试验 二、 （一） 三氯化锑反应 SbCl 3 VitA 蓝色 紫红 CHCl3 条件： 无水、无醇 SbCl3 水 SbOCl 乙醇可使碳正离子的正电荷消失 + CH 2 - SbCl 5 RCOO 蓝色 + CH 2 - SbCl 5 RCOO 紫红 （二） UV法 BP（2005） 无水乙醇 HCl VitA 去水VitA △ λmax为326nm λmax为350～390nm 一个吸收峰 三个吸收峰 ↓ VitA CH 2 去水VitA（VitA3） （三） TLC法 BP 对照品法 显色剂 三氯化锑 USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值 三、 含量测定 （一） UV法（三点校正法） 立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3） 三点校正法 1. 前提条件： （1）杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈 一条直线，且随波长的增大吸收度减小； （2）物质对光的吸收具有加和性。 2. 波长的选择： （1） 1 VitA的max（如VitA酯 328nm） （2） 2 3 分别在1的两侧各选一点 第一法 等波长差法 328 316 340 328 第二法 测定对象：VitA醋酸酯 等吸收比法(皂化法) 6 A1 A2 A3 7 测定对象：VitA醇 3、测定法 （1）基本步骤: 第一步：A选择，A328测定或A328校正 A % % 第二步：求1cm ( 样 ) 1cm(样) C(%) l 第三步 求效价 % E 换算因数 效价（IU / g） (样) 1cm(样) 第四步：求标示量％ IU / 丸 标示量％＝ 100％ 标示量 IU / g 平均丸重 ＝ 100％ 标示量 A 换算因数 平均丸重 C 100％ 标示量 ＝ A*D*换算因数*W W*100*标示量 ×100％ 换算因数： 单位E％1cm数值所相当的效价数 （由纯品计算而得） 效价（IU / g） 换算因数＝ % E1cm(纯) 1IU 0.344g维生素A醋酸酯 6 1 10 g 效价（IU / g） 2907000 0.344g 效价（IU / g） 2907000 换算因数＝ % 1530 E1cm(纯) 1900 1IU 0.300g维生素A醇 6 1 10 g 效价（IU / g） 3330000 0.300g 效价（IU / g） 3330000 换算因数＝ % 1820 E1cm(纯) 1830 （2） 第一法 维生素A醋酸酯 • 方法： 环己烷 S 9～15IU / ml 溶液 分别于300、 316、 328、 340、 360nm 处测Ai • 判断 max是否在326～329nm之间 是 • 求算 Ai / A328 并与规定值比较 否 改用第二法 Ai / A328 A 300 A 316 A 328 A 340 A 360 A 328 A 328 A 328 A 328 A 328 规定值 差值 0.555 0.907 1.000 0 0.811 0.299 • 判断差值是否超过 0.02 有超过0.02 无超过 • 计算 A328（校正） • 用A328计算 A328校正 3.522 A328 A316 A340 f 第二法 A 328(校正) A 328 A 328 A 328校正 －15% －3% f 100% A 328 0 第二 法 3% VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量 差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻 度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶 中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷 为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在 下列波长处测得吸收度为 A300 A316 A328 A340 A360 ：0.354 ：0.561 ：0.628 ：0.523 ：0.216 A300 /A328 A316/A328 A328/A328 A340/A328 A360/A328 求本品中维生素A的含量？ ：0.555 ：0.907 ：1.000 ：0.811 ：0.299 A300 /A328 A316/A328 A328/A328 A340/A328 ：0.564 ：0.893 ：1.000 ：0.833 A360/A328 ：0.344 － － － － － 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 + 0.01 = = －0.01 0 = = + 0.02 = + 0.04 A328校正 3.522 A328 A316 A340 3.522 0.628 0.561 0.523 0.605 f A 328(校正) A 328 A 328 100% 3.7% ( 15% ~ 3%) A 328校正 1900 平均丸重 标示量% 100% C(g / 100ml ) 标示量 0.605 1900 0.08262 100% 2 1 10000 0.2399 100 250 20 99.0% （3）第二法 （等吸收比法） [ 皂化法、6/7A法 ] 适用于维生素A醇 第一法无法消除杂质干扰时用此法 脂溶性 VitA 醋酸酯 VitA 醇 KOH / 乙醇 S 皂化液 植物油 甘油和脂肪酸盐 水溶性 除去植物油的干扰 异丙醇 乙醚提取 挥干乙醚 溶解 稀释至9～15IU / ml 于300、 310、 325、 334nm 处测Ai • 判断max是否在323～327nm之间 是 • 计算 A300 否 A325 取未皂化样品采用 色谱法纯化后再测 定 • 判断 A300 /A325 是否大于0.73 否 是 取未皂化样品采用色 谱法纯化后再测定 • 计算A325(校正) A325校正 6.815 A325 2.555 A310 4.260 A334 f A 325(校正) A 325 A 325 100% A325校正 －3% A325 0 f A325校正 3% （二） 三氯化锑比色法 标准曲线法 VitA SbCl 3 蓝色 λmax 618nm～620nm 优点： 简便 快速 呈色不稳定 （5 ~ 10s内） 水分干扰 H 2O SbCl 3 SbOCl 缺点： 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性 （三）高效液相色谱法 色谱柱：C18柱 流动相：甲醇－水（96：4） 流 速:1.2ml/min 检测波长与AUFS:0min-8min(330nm,0.25AUFS) 用于测定VA ; 8min后（292nm,0.05AUFS）用于 测定VE 内 标：VA醋酸酯 第二节 维生素B1的分析 一、结构与性质 （一）结构 HCl H3C N N NH2 CH2 S N + CH2CH2OH CH3 Cl氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵盐) 二、性质 1.溶解性 (1)易溶于水 (2)水溶液呈酸性 2.硫色素反应 OH O 正丁醇 硫色素 蓝色荧光 3.UV 共轭双键 λmax = 246nm 4.与生物碱沉淀试剂反应 杂原子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂 反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别 和含量测定。 5.氯化物的特性 二、鉴别试验 （一） 硫色素反应 NaOH 专属性反应 H 2O 环合 VitB1 K 3 Fe（CN）6 正丁醇 硫 色素 [O ] H 蓝 色荧 光 荧 光消 失 OH CH 2 N H3C N N NH 2 CH 3 S NaOH C 2 H 4 OH HCl CH 2 N H 3C N N NaS NH 2 O N -H 2 O H3C CH3 N N N CH 3 C2H 4OH NaS C2H4OH 环合 N H3C N N H N ＋2H 2H N H3C CH 3 S N N N C 2 H 4 OH CH3 S C2H4OH 硫色素 （二） 沉淀反应 VitB1 K 2 HgI4 + 淡黄 [ B ] H 2 HgI 4 H I 2 KI 红色 [ B ] HI I 2 + H [ B ] 2 SiO2 OH 2 硅钨酸 白色 + H 12WO3 4 H 2 O 苦酮酸 + 白色扇形 H （三） 其他反应 NaOH S元素反应 Pb Ac VitB NaS PbS NH H O AgNO AgCl 白 HNO 3 HNO KI 淀粉试纸 MnO Cl 蓝 H+ Cl-反应 三、含量测定 （一） 非水溶液滴定法 B Cl HCl HClO B ClO HClO Hg （Ac ） 喹那啶红－亚甲蓝 （紫红→天蓝） （二） UV法 ChP 片剂、注射剂 1% E1cm = 421 A = ECL （每片）相当于标示量的%= A × D × 平均片重 1 % × 100 × W × 标示量 E 1 cm （每ml）相当于标示量的 A× D % × 100 E cm × V × 标示量 × 100 % × 100 % （三） 1、 硫色素荧光法 原理 铁氰化钾 VitB 硫色素 NaOH 异丁醇 荧光 对照液 + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 供试液 + NaOH + 异丁醇 b A C样 d ×C标 S 3、 特点 ´ （1）灵敏度高，线性范围宽 （2）专属性强，氧化产物及代谢产物不干扰，可用 于制剂分析，体液分析等。 S d A b 第三节 维生素C的分析 结构与性质 一、 （一）结构 CH OH 2 6 H C5 OH O 4 HO 1 3 2 二烯醇 内酯 O 两个手性碳（C4,C5） L－抗坏血酸 OH （二）性质 1.溶解性 1、易溶于水 2、水溶液呈酸性 2.酸性 一元酸 C3－OH的 pKa = 4.17 C2－OH的 pKa = 11.57 H CH OH 2 6 C5 OH O 4 HO 1 3 2 O OH 3.旋光性 手性C（C4、C5） L(+)－抗坏血酸 活性最强 CH OH 2 6 H C5 OH * O * HO 4 1 3 2 O OH 4.还原性 二烯醇结构 CH 2 OH CH2OH H C OH O HO 有活性 CH HO CHOH O OH C O OH C O CH 2OH [O] H C OH O O 有活性 H O + - COONa H O 无活性 5.水解反应 与碱反应 Na2CO3 单钠盐 NaOH 水解 酮酸盐 CH 2 OH H C OH O Na2CO3 NaO O OH HO CH2OH H C OH O HO CH 2 OH NaOH O OH CH CHOH C O C O COONa 6.具糖的性质 结构与糖类相似 糖类的显色反应 糠醛 吡咯 显色 △ 糠醛衍生物 H 脱水 H 脱水 吡咯 VitC 糠醛 蓝色 50℃ 7.UV特征 H max nm OH max 65nm 二、 鉴别试验 利用还原性：与氧化剂的反应 [O ] VitC 去氢抗坏血酸 CH 2OH CH2OH H C OH O HO [O ] O OH H C OH O O O O （一）与AgNO3反应 AgNO3 Ag 黑 VitC （二）与2，6 - 二氯靛酚反应 VitC 2， 6 二氯靛酚 无色 氧化型 蓝色 OHˉ OH 还原型 玫瑰红色 H Cl HO （玫瑰色） N O Cl Cl HO H N Cl （无色） OH （三）与其他氧化剂反应 与碱性酒石酸铜反应 USP VitC 碱性酒石酸铜 Cu O 红 与KMnO4反应 VitC KMnO Mn （四）糖类的反应 VitC 戊糖 糠醛 三氯醋酸 脱水 蓝色 CH 2 OH H C OH O HO CH 2 OH H C OH O O HO OH HC OH C C H CHOH 3 CH2OH - CO2 O O H2O O CHOH 3 CH2OH -H2O （戊糖） O O (糠醛) O CHO 50℃ N O CH （蓝色） N H N (吡咯) （五）UV BP 0.01mol/L HCl max 243nm 1% E1 cm 545 ~ 585 三、杂质检查 （一）溶液的澄清度与颜色检查 维生素C原料药 片 糠醛缩合呈色 剂 注射剂 （二）铁、铜离子的检查 维生素C原料药 原子吸收法 催化Vc氧 化分解 四、含量测定 （一）碘量法 原理：利用Vc强的还原性 H VitC I 2 去氢抗坏血酸 I 指示剂 淀粉指示液 CH 2OH H C OH O HO CH 2OH O OH I H+ H C OH O O O + 2 O HI 2、方法 原料药 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过 的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉 指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L） 滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每 1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的 C6H8O6。 3、讨论 （1）新沸冷H2O （2）酸性环境 赶走水中O2 稀醋酸 减慢VitC被O2氧化速度 （3）立即滴定 减少O2的干扰 4.附加剂干扰的排除 片剂 ——过滤 注射剂 —— 抗氧剂 —— Na2SO3 Na2S2O3 NaHSO3 Na2S2O5 丙酮 甲醛 N a 2 S2 O5 + H 2 O N a H SO3 HC HO CH 3COCH 3 OH CH 3 CH 3 C SO3 Na OH H2C S O3Na (二)2，6 - 二氯靛酚滴定法 1、原理 VitC ， 6 二氯靛酚 酚亚胺 2、方法 V样 样 品 HPO3 HAc 二氯靛酚液 V空 空白 自身指示终点法 3、讨论 （1）酸性环境 稳定VitC HPO3-HAc （2）快速滴定 2min内 防止其他还原性物质干扰 （3）亦可剩余比色测定 VitC 二氯靛酚 测A （定量过量） （测剩余染料） （4）缺点 需经常标定 不稳定 贮存≤一周 （5）优点 专属性强，多用于含 Vc的制剂和食品的 分析 （三）高效液相色谱法 血浆中维生素C的测定 标准溶液包括样品预处理过程均需加入 偏磷酸，偏磷酸同时可用于血样中的蛋 白沉淀；当天取血当天测定；处理好的 样品亦需冰箱保存 第四节 维生素D的分析 一、结构与性质 （一）结构 H H CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 维生素 D2(麦角骨化醇) H HO H H H 19 CH2 2 HO 3 H 1 4 10 5 H 7 6 21 CH3 CH3 20 18 22 12 17 11 13 16 14 9 15 8 27 CH3 23 24 25 CH3 26 维生素D3(胆骨化醇) （二）性质 1.性状 无色针状结晶或白色结晶性粉 末；无臭，无味。 2.溶解性 宜溶于有机溶剂，在植物油中 略溶，在水中不溶。 3.不稳定性 含有多个烯键，所以极不稳 定，宜氧化变质，效价降低， 毒性增强。 4．旋光性 维生素D2 6个手性碳原子 维生素D3 5个手性碳原子 5．显色反应 氯仿溶液 醋酐 硫酸 甾类化合物 黄色 红色 紫色 6．紫外吸收特性 无水乙醇 265nm 1% E 维生素D2 1cm 为460－490 1% 维生素D3 E 1cm为465－495 绿色 二、鉴别试验 （一）显色反应 1．与醋酐-浓硫酸反应 氯仿溶液 醋酐 硫酸 黄色 红色 紫色 绿色 2．与三氯化锑反应 本品 1,2-二氯乙烷 三氯化锑试液 橙红色 粉红色 3．其它显色反应 维生素D 三氯化铁 二氯丙醇 乙酰氯 （二）比旋度鉴别 橙黄色 绿色 无水乙醇溶液 维生素D2 比旋度为＋102.5°至＋107.5° 维生素D3 比旋度为＋105°至＋112° （三）其它鉴别方法 薄层色谱法、HPLC法 制备衍生物测熔点 紫外、红外吸收光谱 （四）维生素D2、D3的区别反应 维生素D2 96%乙醇 维生素D3 10ml 乙醇1ml 取0.1ml 和85%硫酸5ml 红色λmax570nm 黄色 λmax495nm 三、杂质检查 （一）麦角甾醇的检查 维生素D290%乙醇溶液 洋地黄皂苷溶液 不得发生浑浊或沉淀 （二）前维生素D的光照产物 R R R OH 5 7 hv ¼Ó ÈÈ hv ¼Ó ÈÈ HO CH2 CH3 ǰάÉúËØD 5,7-¶þÏ© ǰάÉúËØD hv HO Òì¹¹ »¯ hv άÉúËØD hv hv hv R Òì¹¹ »¯ R R CH3 CH2 H HO OH ¹â çÞ´¼£¨lumisterol£© ËÙçÞ´¼£¨tachysterol£© OH 5,6- ·´ ʽάÉúËØD 四、含量测定 正相高效液相色谱法 （一）维生素D测定法 含量以单位表示 每单位相当于维生素D 0.025μg 注意：计算的是维生素D及前维生素D经折 算成维生素D的总量 测定在半暗室及避免氧化的情况下进行 第一法：无干扰杂质 第二法：有VA及其他杂质干扰 第三法：用第二法时，前 VD峰受杂质干扰 仅VD峰可分离 第一法 无干扰杂质 内标物：邻苯二甲酸二甲酯 色谱条件及系统适用性试验： 填充剂：硅胶 流动相：正己烷-正戊醇（997：3） 检测波长：254nm 系统适用 性试验 维 生 素 D3 溶液组成 前维生素D3 △ 光照 与维生素 D3的比保 留时间 0.5 反式维生素D3 0.6 维生素D3 速甾醇D3 分离度 ＞1.0 1.0 1.1 ＞1.0 先后进样5次，维生素D3 峰面积的 RSD≤2.0 % 校正因子测定： 维生素D的校正因子: f1=Asmi/Aims 前维生素D折算成维生素D的校正因子: f2=（Asmr-f1msAr1）/（Ar2ms） 含量测定：计算维生素D及前维生素D折算成 维生素D的总量 mi=（f1Ai1+f2Ai2）ms/As 第二法 有VA及其他杂质干扰 第一步：皂化提取 供试品 加热回流 OH- 供试溶液A 冷却 甲醇溶解 乙醚提取 残渣 乙醚提取液 挥干乙醚 第二步：分离收集 供 试 品 溶 液 A 维生素D RP-HPLC 前维生素D 维生素A及 其他杂质 叠 峰 分 离 内标的正 收集 己烷溶液 挥干 溶解 维生素D及 前维生素D 第三步：按第一法进行含量测定（内标法） 供 试 品 溶 液 B 第三法 用第二法时，前 VD峰受杂质干扰 第一步：皂化提取 同第二法得供试品溶液A 第二步： 供 试 品 RP-HPLC 溶 液 A 前维生素D 叠 维生素D 峰 分 收集 异辛烷溶解 前维生素D 离 90℃、1.5h 挥干 维生素A及 挥干 其他杂质 正己烷 维生素D 溶解 供试品溶液C 第三步：用第一法色谱条件按外标法计算含量 第五节 维生素E的分析 一、结构与性质 （一）结构 O HO 苯并－二氢吡喃醇 CH3 R2 O * * * HO R1 R1 R2 相对活性 α-生育酚 CH3 CH3 1.0 β-生育酚 CH3 H 0.5 γ-生育酚 H CH3 0.2 δ-生育酚 H H 0.1 名 称 CH 3 H3C O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H 3C CO O CH 3 生物效价 右旋体 dl－α－生育酚醋酸酯 ： 消旋体 = 1.4 ：10 （天然品） （合成品） （二）性质 1、溶解性：易溶于有机溶剂，不溶于水 2、水解性：酯键易水解 3、氧化性 H orOH VitE 生育酚 △ [O ] 醌型化合物 4、UV 二、鉴别试验 （一） 硝酸反应 HNO 3 VitE 生育酚 75℃15′ [O ] 生育红 橙红色 CH 3 H 3C O C 16 H 33 强氧化剂 HO CH 3 HNO3 CH 3 H3C O CH 3 C 16 H 33 生育红 （橙红色） O O CH 3 生育酚 （二） 三氯化铁－联吡啶反应 KOH Fe 3 VitE 生育酚 [O] △ 对 生育醌 Fe 2 联吡啶 红色 CH 3 CH 3 H 3C O CH 3 C 16H 33 HO CH 3 生育酚 Fe3+ [O] H 3C O OH CH 3 C 16H 33 O CH 3 对-生育醌 2+ N N 2+ Fe + 3 N Fe N 3 红色 （三） UV法 0.01%无水乙醇中 λmax = 284nm λmin = 254nm （四） TLC法 薄层板 硅胶G 展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1） 显色剂 硫酸（105℃ 5′） VitE Rf = 0.7 三、杂质检查 （一）酸度 游离醋酸 （二）生育酚 1.原理 利用游离生育酚的还原性， 将硫酸铈还原成硫酸亚铈 生育酚 2Ce 4 2Ce 3 对 生育醌 2.试剂 硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 二苯胺（亮黄→灰紫） 四、含量测定 （一） 1、 GC法 GC特点 选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好 挥发性低、不稳定、 极性强→衍生化。 易受样品蒸气压限 制 2、VitE测定的色谱条件 载气→N2 固定液→硅酮（OV-17） 担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃ 检测器→氢火焰离子化检测器(FID) 内标→正三十二烷 n ≥ 500 R≥2 内标法加校正因子定量 内标法 供试液（样品+内标） 对照液（对照+内标） 内标物 是样品中不存在的物质 与被测组分峰靠近 能与各组分完全分离 与被测组分的量接近 （二）RP - HPLC法（外标法） 样品→ dl－α－生育酚 固定相→十八烷基硅烷键合硅胶 流动相→甲醇-水（49 ：1） 检测波长→292nm R＞2.6 RSD≤0.8% （三）荧光分光光度法 对照品→ dl－α－生育酚 在220~400nm波长范围内，以发射、激发 波长间隔Δλ为40nm扫描同步荧光光谱， 测定同步荧光峰的荧光强度信号值。 F样品 - F空白 4.0（mg/L) VE = F标准 - F空白 第六节 复方制剂中多种维生素的分析 一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺 酸钠作为抗氧剂 二、反相HPLC法同时测定9种水溶性维生素 三、非水反相HPLC法同时测定4种脂溶性维生素