Transcript tes serologi dr Febtarini, Sp.PK

IMUNOASAI
(PEMERIKSAAN SEROLOGI)
Departemen Patologi Klinik
Univ. Wijaya Kusuma Surabaya
dr. Febtarini R, Sp.PK
Serologi
• Suatu ilmu yang mempelajari cara mendeteksi suatu
infeksi di dalam serum pasien, misalnya adanya antibodi
(Ab) spesifik terhadap mikroba tertentu
• Uji serologi didasarkan atas ikatan spesifik antara antigen
(Ag) dan antibodi (Ab)
 Ag yang telah diketahui akan bereaksi/berikatan dengan
Ab yang belum diketahui di dalam serum
 Sebaliknya Ab yang telah diketahui dapat digunakan untuk
mendeteksi Ag dalam serum pasien
• Reaksi Ag-Ab dapat diamati atas terbentuknya presipitasi,
aglutinasi atau dengan bantuan label tertentu, misalnya
label radioaktif, label enzims dll
2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu
ANTIBODI
Fc
-S-S-S-S-S-S-
Regio
variabel
Fab
L
H
L H
Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi
L = Light Chain
H = Heavy chain
Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai
a. Spesifitas dari Ab
Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak
kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur
mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya
tergantung dari :
- profil spesifitas Ab-nya &
- kemurnian Ag-nya
Ab yang amat spesifik = Ab dengan binding
sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan
struktur molekul yang unik/tertentu saja.
Antigen I
X
Y
Z
Antigen II
V
W
X
Antibodi I
x
y
z
Antibodi II
v
w
x
X x
Y y
Z z
Z
Y
X x
w
v
Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu
epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi
yang mungkin terbentuk
b. Ukuran kuantitas Ab
Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam
serum.
- Kualitatif pos. /neg.  adanya perubahan fisik dari
bahan pemeriksaan. (+/-)
- Semi kuantitatif ; ditentukan dengan pengenceran
serum secara progresif  Titer (1/10, 1/100, 1/640)
- Kuantitatif ; ditentukan dengan menggunakan
beberapa sera baku  kurva baku. Akurasi dicek
dengan serum kontrol. (100 pg/mL, 2 μL/mL)
Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.
OD
X
0
5 g/dl
Kadar Bahan
Gambar 3. Kurva baku uji ELISA
FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI
1 Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara
penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin
dll
2 Elektrolit dan pH
3 Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahap
a. Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuai
b. Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll)
4 Mekanisme Daya Tahan Nonspesifik
Bahan yg normal/abnormal terdapat dalam
sekret/cairan tubuh.
5 Rasio Ag dan Ab
prozone
postzone
Prozone,
Tak ada presipitasi
Equivalent zone,
Presipitasi
Post zone,
Tak ada presipitasi
Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan
implikasinya
= ANTIBODI
= ANTIGEN
BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI
MACAM BAHAN : serum , plasma, css
Usahakan jangan hemolisis
Inaktivasi C  56°C, 30 menit
Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat
sendiri dari strain lokal, lebih baik yang
multistrains.
IMUNOASAI
KADAR BAHAN
RENDAH ( ng/ml, pg/ml )
TINGGI (mg/ml,ug/ml)
Hasil reaksi tak tampak
Hasil reaksi DAPAT
DILIHAT
 Presipitasi/RID
FAKTOR PENGUAT (LABEL)
IF
RIA
EIA
Homogen
 UJI AGLUTINASI
ICA
Heterogen
= ELISA
JENIS IMUNOASAI
Ada 2 jenis imunoasai.
I. IMUNOASAI TAK BERLABEL
II. IMUNOASAI BERLABEL
I. IMUNOASAI TAK BERLABEL
 UJI PRESIPTASI
 UJI AGLUTINASI
 UJI FIKSASI KOMPLEMEN
 UJI NETRALISASI TOKSIN
UJI PRESIPITASI
Ag yang
larut
Antibodi
Presipitasi adalah bila Ag + Ab dalam
bentuk larutan menghasilkan suatu
agregasi yang terlihat dengan mata
PRESIPITASI
Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi
Ag.
Inkubasi
Serum dengan Ab
Presipitasi
Gambar 6. Uji presipitasi tabung
Sera baku
1
Tes serum
2
8
3
Antisera
dalam agar
7
Tes serum
4
6
Tes serum
Tes serum
5
Tes serum
GAMBAR 10. R.I.D
APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI
Uji Tabung
: VDRL - Makro
Uji Slide
: VDRL - Mikro
Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP
RID
: Penentuan kelas Ig
Imunoelektroforesis
• Migrasi protein serum di dalam
gel dan apabila bertemu dengan
antigen yang sesuai akan terjadi
presipitasi
UJI AGLUTINASI
Ag. pada permukaan sel
Aglutinasi
Ab.
Tak larut
Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi
Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide
+
-
Susp.
Ag
Inkubasi
Aglutinasi
Serum ( Ab )
Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung
AGLUTINASI TAK LANGSUNG
A. AGLUTINASI PASIF
B. Ab TAK LENGKAP
a. Ab Monovalen
b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )
+
+
Ag Larut
Partikel
Ab dalam serum
Partikel disalut Ag
Partikel:
Seldarah merah
Lateks
Carbo adsorben
(Ko-aglutinasi)
Gambar 14. Uji aglutinasi pasif
Aglutinasi
APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI
 Uji Slide (lempeng): uji Widal slide
 Uji Tabung : uji Widal tabung
 Aglutinasi Tak Langsung: uji Rose-Waaler
III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh
IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN
Hampir sama dengan uji aglut. tak langsung,
Hanya Anti – Ig diganti C  Lisis Imun
UJI LISIS IMUN & FIKSASI
KOMPLEMEN
• Komplemen di dalam plasma sebanyak 3
mg/ml dalam bentuk inaktif
• Jika bertemu dengan kompleks Ag-Ab
komplemen menjadi aktif (melalui jalur
klasik), dan menghasilkan berbagai kaskade
aktivasi, misalnya lisis dari sel target
Prinsip Uji
Komplemen
Uji Lisis Imun
Komplemen
Ab
Ag pada
permukaan sel
Sensitized cell
= Komplemen
Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun
A.
Komplemen
C
Serum
dgn. Ab
Komplemen
Tak ada
Lisis
C
Terikat
Sensitized SDM
Uji Positif
B.
Komplemen
Komplemen
C
C
Serum
tanpa Ab
Lisis
Bebas
Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen
Uji Negatif
An example of the complement fixation test.
Fig. 17.14 Complement fixation test.
II. IMUNOASAI BERLABEL
1. CAT FLUORESENS: IF
2. RADIOISOTOP: RIA
3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA )
A. EIA HOMOGEN
B. EIA HETEROGEN (ELISA)
C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE
4. EMAS KOLOIDAL:
ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)
1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF)
Mikroskop
Fluoresens
CUCI
Ag tak diket.
Fiksasi pada
slide
Ab diket berlabel cat
fluoresens
Kompleks Ag-Ab
Berfluoresensi
Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens
langsung (direct).
Cuci
Ag diket.
Ab tak
diket
AHG dilabel
Fluorescein
Kompleks Ag – Ab
tak tampak
Cuci
Mikroskop
Fluoresens
Kompleks Ag – Ab – AHG
berfluoresensi
Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens
tak langsung (indirect).
An example of direct and indirect immunofluorescence
testing.
Fig. 17.15 Immunofluorescence testing
KELEMAHAN UJI IF
 Peralatan canggih dan mahal
 Perlu tenaga terlatih
 Per hari maks 25 slide / analis
 Sukar dibuat otomatis
 Pelaksanaan agak kompleks & membosankan
2. Uji RIA
R
R
R
R
R
R
R
RR
Radioisotop : 3H Thymidin, 131 I
Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA
R = label radioisotop
Radiation
Counter
R
R
R
R R
R
Cuci
R
RADIATION
COUNTER
Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif
KELEMAHAN UJI RIA
 Butuh alat mahal & tenaga terlatih
 Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 – 2 bln )
 Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.
 Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• Prinsip dasar Elisa adalah pemakaian enzim
untuk mendeteksi adanya ikatan AntigenAntibodi (Ag:Ab)
• Enzim akan merubah (mengkonversi)
substrate yang tidak berwarna (kromogen)
menjadi produk berwarna yang
mengindikasikan adanya ikatan Ag:Ab
Ab
Ag pada
Fase padat
Anti –Ig berlabel
enzim
SUBSTRAT
berkromogen
PRODUK
berwarna
Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA langsung
Direct ELISA
• Untuk mendeteksi Ab
Enzim: AK (Alkalin fosfatase) atau HRPO (Horse Raddish
Peroxidase)
Substrate : TMB (Tetra methyl benzidine) atau NPP (pnitrophenyl phosphate)
Ag
Ab II berlabel
enzim
SUBSTRAT
berkromogen
Ab I pada
Fase padat
PRODUK
berwarna
Gambar 23. Prinsip dasar (tak langsung)
double antibody sandwich ELISA
Indirect ELISA (Sandwich ELISA)
• Untuk mendeteksi adanya antigen (Ag)
ELISA
Antibodi dilapiskan pada dasar sumuran
Bahan yg diperiksa ditambahkan → terjadi
reaksi Ag-Ab
Ditambahkan anti-antibodi ( Mo anti-Ab)
berlabel BIOTIN (biotinylated)
Ditambahkan streptavidin berlabel enzim
Ditambah kromogen → Warna, diukur secara
kolorimetri memakai Elisa-reader
Uji ELISA
Ag dlm serum
SUBSTRAT
BERKROMOGEN
Ab pada
Fase padat
Ag berlabel
enzim
PRODUK
berwarna
Gambar 22. Prinsip dasar uji ELISA kompetitif
An example of the indirect and capture ELISA methods.
Fig. 17.16 Methods of ELISA testing.
CONTOH APLIKASI KLINIS
SEROLOGI TEST
1. Sifilis
2. Demam tifoid
3. Tuberkulosis
SIFILIS
Paling Ideal ; Ig. M- ELISA ( Dx, keaktivan,
mengikuti hasil Rx )
Di Indonesia ;
TPHA  Dx
VDRL  Aktivitas &
mengikuti hasil Rx
Neurosyphilis : VDRL  Dx
Jumlah sel
Protein Total
Keaktivan &
mengikuti hasil Rx
UJI SEROLOGI DEMAM
TIFOID
1.
2.
3.
4.
TES WIDAL
TES IgM Salmonella
ELISA
BIAKAN / KULTUR DARAH
UJI WIDAL (AGLUTINASI)
Dari hasil 1X tes belum dapat ditarik kesimpulan yang berarti.
Perlu ulangan setelah 5-7 hari
Harga normal tes Widal tabung.
Aglutinin O : 1/160
Aglutinin PA : 1/80
Aglutinin H : 1/160
Aglutinin PB : 1/320
Vaksinasi; aglutinin H dapat dipertahankan beberapa
tahun,
Antibiotika ; dapat memperlambat kenaikan titer
INDIKASI SEROLOGI TB
•
1.
2.
3.
4.
INDIKASI:
BTA DAHAK NEGATIF
TB EKSTRAPULMONUM
TB ANAK
SPESIFISITAS:
–
TGT JENIS ANTIGEN (REAKSI
SILANG)
5. KONTROVERSI KARENA:
–
–
Kurang pemahaman patogenesis
Bersikukuh pada Postulat Koch
Lateral
flow
immuno
assay
LATERAL FLOW IMMUNOASSAY
62
CONTOH PARAMETER
PEMERIKSAAN SEROLOGI
CRP = Protein C reaktif
- Suatu alfa globulin yg ada di serum pd inflamasi
- Suatu reaktan fase akut, indikator non spesifik
inflamasi yg berhbgn dg imunologi
- Tidak dipengaruhi oleh anemia, kehamilan,
hiperglobulinemia
- serial, utk indeks aktivitas penyakit dan
monitoring terapi
FAKTOR
Antibodi
REMATOID
Rheumatoid
factor
•Poliklonal antibodi
•Antibodi IgG dalam kelas IgM
•Kadar IgM terbesar, bisa dideteksi oleh alat
•Antibodi terhadap determinan antigenik pada fragmen Fc immunoglobulin
Sumber: PKB PK,2002
64
TERIMA KASIH ATAS
PERHATIAN ANDA