Transcript 包埋法固定SOD

实验：包埋法固定SOD
及固定化酶性质测定
一、实验目的要求

了解酶的固定方法及其应用

掌握包埋法制备固定酶的操作方法
二、实验原理
固定化酶(immobilized enzyme) :
固定化酶又称固相酶。通过物理或化
学的方法将水溶性的酶与水不溶性载体结
合，或使酶固定在一定的空间范围内进行
催化反应。
固定化酶的特点：
可使生产工艺自动化，连续化，增强
酶的抗性，提高酶的使用效率．
酶的固定化方法：
• 吸附法固定化技术（物理吸附法－活性炭）
• 包埋法固定化技术（琼脂糖，ＰＡＧＥ琼脂、
海藻酸盐，聚酰胺、聚脲、 聚酯）
• 结合法固定化技术（共价，离子）
• 交联固定化技术（戊二醛、亚乙基二异氰
酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐）
固定化酶的应用
•可装成酶柱用于连续生产．
•可以制成酶膜、酶管等多种形式的酶反应器。
•要用于生产精细的特殊化学品、药品
•食品工业中也将得到广泛使用
•用于各种疾病的诊断、治疗及人工脏 器
•用作化学分析的酶电极
•固定化酶用作燃料电池
•固定化酶用作亲和层析手段，分离和提纯酶
的底物、辅酶、抑制剂及抗体等，
酶活性测定原理
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超
氧阴离子自由基,
 超氧阴离子自由基氧化羟胺形成亚硝酸盐．
 亚硝酸盐在显色剂的作用下呈现紫红色．
 用可见分光光度计测其吸光度.
（当被测样品中含SOD时, 则清除超氧阴离子自
由基的作用,减少亚硝酸盐的形成.通过测定
样品管和对照管的吸光度就可以计算出样品
中的SOD活力.）

SOD活力计算
SOD活力＝
(U/ml)
对照OD值-样品OD值
对照OD值*50％
x稀释倍数
（每毫升反应液中SOD抑制率达50%时
所对应的SOD量为一个SOD活力单位）
三、实验步骤
本实验是用一定浓度的聚丙烯酰胺作为包埋剂，将SOD包
埋在多孔的网状结构的聚丙烯酰胺凝胶内而制成固定化酶。
1. 22.5％聚丙烯酰胺固定化酶液配制：
取一个EP管，按下表配制固定酶液（1ml）
配制完后立即混匀
2.球状固定化酶的制备：用取样器吸取
50μL(胶-酶混合液) ，分别滴加到白瓷
板的20个孔中，待凝胶聚合。
3.冲洗凝胶表面未固定化的SOD酶。
用蒸馏水洗涤球状固定化酶3-5次。
4.固定化酶活性测定：采用黄嘌呤氧化法测
定SOD活力(方法看SOD活力测定试剂盒说
明).
试剂(ml)
试剂一
样品
试剂二
试剂三
试剂四
样品管
1.0
加固定酶
0.1
0.1
0.1
对照管
1.0
不加
0.1
0.1
0.1
充分混匀后,37度水浴40分钟, 加
显色剂
2
2
混匀, 室温放置10分钟, 波长550nm, 蒸馏水调零,比色
5. 固定化酶热稳定性的测定




取三支试管，分别加入SOD酶液5μL ，
蒸馏水5μL及10个球状固定化酶，放到
75℃ 水浴保温10min。
取出迅速冷却到室温。
按上表各加入SOD反应液 。
测定OD 550nm值。
四、实验结果与分析
1.计算SOD固定化酶的活性
2.计算热处理后固定化酶和游离酶的活性。
3.SOD固定化酶活力损失多少。
4.比较固定化酶和游离酶对热的抗性情况。
5.对实验结果进行分析。
五.实验注意事项
1.凝胶与酶是否混匀
2.凝胶是否凝固
3.冲洗时凝胶不要破裂
4.固体酶反应测定活性时固体酶要分离