Transcript 包埋法固定SOD
实验:包埋法固定SOD
及固定化酶性质测定
一、实验目的要求
了解酶的固定方法及其应用
掌握包埋法制备固定酶的操作方法
二、实验原理
固定化酶(immobilized enzyme) :
固定化酶又称固相酶。通过物理或化
学的方法将水溶性的酶与水不溶性载体结
合,或使酶固定在一定的空间范围内进行
催化反应。
固定化酶的特点:
可使生产工艺自动化,连续化,增强
酶的抗性,提高酶的使用效率.
酶的固定化方法:
• 吸附法固定化技术(物理吸附法-活性炭)
• 包埋法固定化技术(琼脂糖,PAGE琼脂、
海藻酸盐,聚酰胺、聚脲、 聚酯)
• 结合法固定化技术(共价,离子)
• 交联固定化技术(戊二醛、亚乙基二异氰
酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐)
固定化酶的应用
•可装成酶柱用于连续生产.
•可以制成酶膜、酶管等多种形式的酶反应器。
•要用于生产精细的特殊化学品、药品
•食品工业中也将得到广泛使用
•用于各种疾病的诊断、治疗及人工脏 器
•用作化学分析的酶电极
•固定化酶用作燃料电池
•固定化酶用作亲和层析手段,分离和提纯酶
的底物、辅酶、抑制剂及抗体等,
酶活性测定原理
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超
氧阴离子自由基,
超氧阴离子自由基氧化羟胺形成亚硝酸盐.
亚硝酸盐在显色剂的作用下呈现紫红色.
用可见分光光度计测其吸光度.
(当被测样品中含SOD时, 则清除超氧阴离子自
由基的作用,减少亚硝酸盐的形成.通过测定
样品管和对照管的吸光度就可以计算出样品
中的SOD活力.)
SOD活力计算
SOD活力=
(U/ml)
对照OD值-样品OD值
对照OD值*50%
x稀释倍数
(每毫升反应液中SOD抑制率达50%时
所对应的SOD量为一个SOD活力单位)
三、实验步骤
本实验是用一定浓度的聚丙烯酰胺作为包埋剂,将SOD包
埋在多孔的网状结构的聚丙烯酰胺凝胶内而制成固定化酶。
1. 22.5%聚丙烯酰胺固定化酶液配制:
取一个EP管,按下表配制固定酶液(1ml)
配制完后立即混匀
2.球状固定化酶的制备:用取样器吸取
50μL(胶-酶混合液) ,分别滴加到白瓷
板的20个孔中,待凝胶聚合。
3.冲洗凝胶表面未固定化的SOD酶。
用蒸馏水洗涤球状固定化酶3-5次。
4.固定化酶活性测定:采用黄嘌呤氧化法测
定SOD活力(方法看SOD活力测定试剂盒说
明).
试剂(ml)
试剂一
样品
试剂二
试剂三
试剂四
样品管
1.0
加固定酶
0.1
0.1
0.1
对照管
1.0
不加
0.1
0.1
0.1
充分混匀后,37度水浴40分钟, 加
显色剂
2
2
混匀, 室温放置10分钟, 波长550nm, 蒸馏水调零,比色
5. 固定化酶热稳定性的测定
取三支试管,分别加入SOD酶液5μL ,
蒸馏水5μL及10个球状固定化酶,放到
75℃ 水浴保温10min。
取出迅速冷却到室温。
按上表各加入SOD反应液 。
测定OD 550nm值。
四、实验结果与分析
1.计算SOD固定化酶的活性
2.计算热处理后固定化酶和游离酶的活性。
3.SOD固定化酶活力损失多少。
4.比较固定化酶和游离酶对热的抗性情况。
5.对实验结果进行分析。
五.实验注意事项
1.凝胶与酶是否混匀
2.凝胶是否凝固
3.冲洗时凝胶不要破裂
4.固体酶反应测定活性时固体酶要分离