Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze Hasonlítása - glomerulus TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben Bombix mori csáp km.

a: konvencionális b: kriofixálás c: freeze-substitution

STEM – EELS anyagszerkezeti alkalmazás

Növényi elektronmikroszkópos technikák

1. Áttekintés

1.1. Az EM munka célja 1.2. Feltételei 1.3. Lehetőségei 1.4. Korlátai

1.4.1 Felbontás - mélységélesség 1.4.2 Felhasználhatóság - alkalmazhatóság 1.4.3 Hibái – műtermékek 1.4.4 Költség, idő

1.5 Az EM, mint módszer értékelése

2. Konvencionális minta-előkészítés TEM-re

2.1 Főbb lépések: ultramikrotóm

mintavétel

----------------

FM

fixálás víztelenítés átitatás beágyazás

– minta blokkban kés grid (hártya)

metszés

------------

FM

festés

TEM

EREDMÉNY

VIZSGÁLAT

„processing”

1947, in vitro tenyésztett sejt széli régiója patkány mirigyes szövet A:1956 B:1962 – minőségi változás jelentős

2.2 Történetiség

2.2.1 Műszaki fejlődés 2.2.2 Tudományos fejlődés

3. Mintavétel

3.1 A minta kiválasztása 3.2 Mintaszám 3.3 Minták kezelése

3.3.1 Manuális munka 3.3.2 Dokumentálás – fixálási napló

4. Fixálás:

life-like state /változás minimalizálása/ Fixálás jó: minta olyan, mint FM-ben /félvékony metszeten/ ha strukturális sérülés nincs ha térfogatváltozás nincs ha különböző fixálókkal is u.a. az eredmény

Fixáló:

+

stabilizálja az „élő” struktúrát attól (jelentősen) eltérő struktúrát eredményez rossz fixálás: fiziológiás elváltozás strukturális elváltozás apróbb (strukturális, térfogati) változás jó fixálás: 4.1 Fixáló oldat: nincs látható elváltozás

a.

fixáló ágens

b.

hordozó közeg Fixálási környezet: pH ozmolaritás ion koncentráció és összetétel

4.1.1. Fixálók

: teroxidok /OsO 4 , RuO 4 , ruthenium hexammine trichloride/ aldehidek /GA, FA, akrolein, stb./ KMnO 4 uranil acetát

4.1.2 „Hordozó” közeg:

/és más permanganátok/ követelmények: állandó pH fixálás során ozmolaritás ionösszetétel ne legyen toxikus, büdös pufferek + ozmotikumok + ionok foszfát puffer /Sörensen f./ kakodilát puffer veronál acetát puffer kollidin szerves pufferek jó As (toxikus) barbiturál (toxikus) és büdös büdös (piridin) jók, de drágábbak

4.1.2.1 pH: 6.8 – 7.5 (8) OsO 4 – pH: 6.0

uranil acetát – pH: 5.0

4.1.2.2 Ozmolaritás: minta saját ozmolaritása (optimális) fixáló penetrációja membrán permeábilitás változás fixáláskor fixáló ozmotikumként viselkedik-e

kissé hipertóniás jobb, mint hipotóniás

beállítás: puffer koncentráció (itt nem a fixálóé!) fixáló koncentráció ozmotikum (NaCl, glukóz, szacharóz, mannitol) gl., szach. OsO 4 -nál nem, aldehideknél jó 4.1.2.3 Ionösszetétel: monovalens jó (NaCl) bivalens membránokra jó, De: precipitáció, fiziológiás elváltozás (Ca, Mg, bikarbonát) lehet!

Amőba sejt részlete A: konvencionális, enyhén hiperozmotikus környezet B: freeze-substitution Apró különbségek: plazmamembrán és vakuolumok membránjainak „kifeszült” megjelenése

4.2 Pufferek:

4.2.1 Foszfát puffer

:

+

fiziológiás bivalens ionok

-

nem toxikus pH nem változik a hőmérséklettel, stabil precipitáció lehet mikroorganizmusok szeretik lassú penetrációjú és reaktív fixálókhoz is Sörensen féle mono- és dibázikus Na-foszfát Na-K-foszfát

4.2.2 Kakodilát puffer

:

+

stabil nincs csapadék rossz szagú toxikus aldehidekkel (első fix.) foszfát pufferhez hasonló eredmény

4.2.3 Veronál acetát puffer

:

+

nincs csapadék /2. és 3. fix./

-

csak néhány szövetre jó (OsO 4 -el) nem tárolható (mikroorganizmusok) aldehidekkel reagál (puffer kapac.)

4.2.4 Kollidin

:  -(s)-kollidin (2.4.6-trimetil piridin)

Nem ajánlható, csak speciális esetben!!

+

pH:7.4-nél igen jó puffer kapacitás szobahőn is stabil jól penetrál – nagy blokkok fixálása extrakció - OsO 4 membránsérülések toxikus és büdös /nagy blokk és 2. fix. -jobb/

4.2.5 PIPES puffer

: piperazin-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) 0.3 M ozmolaritást ellenőrizni /2x-3x hígítani/ pH 6.1-7.5 között 0.1 M NaOH

4.2.6 HEPES puffer

: N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid 0.2 M pH 6.8-8.2 között -0.2 M NaOH

4.2.7 MOPS puffer

: 3-(N-morpholino)propane-sulfonic acid 0.2 M pH 6.5-7.9 között-0.2 M NaOH

Neutrofil granulocita A B FA+foszfát puffer – jó struktura FA+kakodilát puffer – jó struktura C FA+kollidin – erős kimosódás, membránsérülések

4.3 Fixálók:

4.3.1

Tetroxidok

4.3.1.1 OsO 4 : 1927 Strangeway and Canti – FM fixálók sötétlátóteres mikroszkópia - „jobb felbontás” 1940-1950 EM – első ultravékony metszetek lassú penetrálás – kicsi minta /0.5-1 mm átmérő/ /puffer meggyorsíthatja – ion és membrán kölcsönhatás/ főként lipideket (foszfolipid) fixál /ezeket aldehidek nem!/ festés is egyben membrán permeábilis lesz – minta ozmolaritása változik /puffer kevésbé fontos 2. fix.-nál/

Os 4 fixálásra elváltozás: mielin – zsugorodás izolált sejtek – enyhe duzzadás (NaCl) Ca – jó /1-3 mM , ha több: precipitáció) Mg – jobb??

csersav hozzáadása: jobb fixálás, jobb nehézfém ion kötés Forgalmazás: kristályos ill. oldott - ampulla Tárolás Előkészítés: törzsoldat oldás – 24 óra!!!

szonikálás – rövidebb idő használat: elszívófülke!!! /erősen párolog/ hulladék kezelése műanyagon át is penetrál

használat: elszívófülke!!! /erősen párolog, nyálkahártya irritáló/ erős oxidálószer – mindent feketére színez hulladék kezelése műanyagon át is penetrál alkalmazhatóság: foszfát puffer + OsO 4 kakodilát puffer + OsO 4 veronál a. puffer + OsO 4 kollidin + OsO 4 – jó (de csersavval nem) – inkább 2. fix., (csersavval is) – nem ajánlott (2. fixálás) – nem ajánlott (2. fixálás) ma: GA után, mint 2. fixáló

4.3.1.2

Ruténium tetroxid (RuO 4 ) fixálás-festés 1887-től napjainkban részben hisztokémia, részben fixáló fixáláskor történő alkalmazása ritka

+

poliszacharidokkal is reagál finomszemcsés festődés – jobb feloldás

-

nehezen penetrál, külső sejteket fixálja csak gomba sejtfalon (intakt) is nehezen jut át protoplasztok, izolált sejtek, kis minták (  1 mm 3 ) jó szobahőmérsékleten fixálás (4 o C nem ajánlott) erőteljes oxidálószer, bomlékony (friss: aranysárga) egészségre káros - elszívófülke

forgalmazás: kristályos 0.5 % oldat – ampullában fixálás (egyben festés): 0.03-0.05% RuO 4 oldat

4.3.1.2 RHT – Ruthenium hexammine trichloride Mw: 309.6

inkább festék, de OsO 4 után alkalmazzák nagy töltéssűrűség (3 + ), kis molekulasúly, nincs aggregáció OsO 4 után RHT (kakodilát puffer) – nem kell utólagos festés finomszemcsés festődés – jobb feloldás GA-val stabilizáló (kakodilát p.) –

proteoglikánok, szénhidrátok, extracelluláris mátrix

+ 2.5 % GA + 1% OsO 4 0.1-0.7 % RHT pH: 7.4 fixálás: szoba hőmérsékleten (4 o C nem ajánlott) oldatot használat előtt 1 órával csinálni!!! /bomlás/ foszfát puffer és kollidin nem optimális hozzá forgalmazás: aranysárga por, stabil forma éveken át

4.3.2 Aldehidek

glutáraldehid formaldehid : paraformaldehid

O – C H O H C –

CH 2 – CH 2 – CH 2

– C O

H –

C H O O H C

– O– CH 2 (– O CH 2 ) n – O –

C H

CH2

O H

akrolein CH

C O H

(glioxál, krotonaldehid, acetaldehid, metakrolein) foszfát és kakodilát pufferben jó fixálók (esetleg kollidin)

4.3.2.1 Glutáraldehid (GA): önállóan nem jó igazán napjainkban: GA + OsO 4 /OsO 4 sem!/ illetve (FA+GA) + OsO 4

+

dialdehid – keresztkötés – tárolható minta fehérjékkel reagál – OsO 4 mellett fehérje extrakció kisebb /glikogénnel reagál – OsO 4 erősebben festi/ - lipidekkel nem reagál /akár 95% veszteség, OsO 4 ezt csökkenti/ nem változtatja meg az ozmotikus viszonyokat a mintában belépéskor, így a puffer ozmolaritása meghatározó Tehát GA jó fixáló, de OsO 4 utófixálás elengedhetetlen

GA minősége: monomer – polimer aránytól függ tisztítás: /280 nm/ /235/ nm desztillálás 100-101 o C (olaj 154 o C) aktívszenes mosás – szűrés tárolás: hőmérséklet igen fontos (+4, vagy -20 o C) forgalmazás: ampullázott (25, 50%) „nyers” oldat (elvileg 25%) pH: 6.8 – 7.5 (7.5 felett GA polimerizálódik) használat: 2 - 4% első fixálóként (0.05% előfixálásnál) Ca használata nem zavaró pufferek: foszfát puffer – jó kakodilát puffer – jó veronál acetát puffer – nem használható kollidin – nem ajánlott szerves pufferek – jók

4.3.2.2 Formaldehid (FA):

+ -

eleinte rossz volt (11-16% metanol!) paraformaldehidből frissen – jó fixáló jól penetrál (nagyobb blokkok, precipitáció kisebb) foszfát puffer kissé lemarad fehérjékkel reagál – de monoaldehid!

lipidekkel is reagál (korlátozottan) fixálás után a minta pufferben nem tartható el hosszan lipidekre utófixálás kell FA nem ozmotikum – puffer ozmolaritása meghatározó (membrán szemipermeabilitás részben megmarad) FA jó fixáló, jól penetrál, de OsO 4 utófixálás kell, Ca jó

FA felhasználás: foszfát puffer – kakodilát puffer – jó, Ca kell, hűtőben stabil – 4% FA veronál acetát puffer – kerülni kollidin – jó, ha lehet, ezt használni – 4% FA 10% FA nagy blokk, jobb behatolás, de extraktív, ezért csak indokolt esetben GA + FA keverék jobb hatásfokú első fixáláshoz FA gyors penetráció, reaktívabb GA keresztkötések, stabilizál 4% FA + 2% GA + 0.03% CaCl 2 0.07–0.1 M kakodilát /foszfát/ puffer

4.3.2.3 Akrolein: nagy/tömött/növényi minták

+

leggyorsabban penetráló aldehid fixáló /0.5-1%/

-

toxikus lipidoldó hatás enzimaktivitást gátló mikrotubulusok szétesnek Akrolein+GA – FA+GA alternatív /OsO 4 utófixálás kell/ 1% akrolein + 2-4% GA (0.1 M foszfát puffer, pH 7.2) ozmolaritás, CaCl 2 vagy MgCl 2 1-3 mM Akrolein+GA+FA igen tömör, növényi anyagokhoz

4.3.3 Permanganátok:

KMnO 4 /Na-, Zn-, Ba-, La-permanganát/ régebben gyakori volt , ma botanikai, mikológiai, membránvizsgálatoknál kivételesen

-

extraktív hatás (GA+ OsO 4 fixálás hasonlítás) fehérje, lipid (membránt is károsítja) RNA (DNA megőrződik, bár rosszul) duzzadás, morfológiai deformáció – 0.5% NaCl 0.5-1% KMnO 4 /K 2 Cr 2 O 7 + OsO 4 jobb, de nem jelentősen/

4.3.4 Keverék fixálók:

pl. GA + OsO frissen készíteni 4

együtt

más hatás, mint egymás után – reagálnak más állapotúak (?) kompetició az aminosavakért (?) 2.5% GA+1% OsO 4 0.1M kakodilát pufferben (pH:7.2), utófixálás uranil acetátban 0 o C max. 1 óra

4.3.5 Speciális fixálók:

inkább csak adalékként szerepelnek uranil acetát: membrán stabilizáló (?) enyhe extrakció /pl.glikogénre/ 0.25-2% víz, veronál acetát puffer pH:5.0 !!

/foszfát és kakodilát nem, kiválások!/ ferricianid, digitonin, trinitro-komponensek (pikrinsav származékok)

4.4 Fixálás módja: általános recept nincs!

irodalmi receptek hasonlót adaptálni - módosítani általános szempontok: gyorsan (degradáció megelőzése) immerziós in situ perfúziós kicsi minta (penetráció), ha nagy minta – nagy penetrációjú fixáló és puffer (FA, akrolein, kollidin) keverés kicsi edények (anyag, pénz) idő /mintafüggő/ - hosszú: műtermék képződés hőmérséklet /pl. mikrotubulusok alacsony hőn rosszul/ mikrohullámú sugárzás diffúzió /hő!/ rotáció reakció ráta

mosás: aldehid – OsO 4 között fontos 0.5-2 óra /éjszaka/ - tárolás mosás a „hordozóval” /bár ozmolaritás itt már nem olyan fontos/ növényi minták: vízvesztést kerülni, kicsi minta, kettős fixálás, vákuum – szőrök közötti, intercelluláris térben levegő

gombák:

mint növények, celofán módszer

monolayer kultúrák:

petri csészében,tárgy-, vagy fedőlemezen (teflon spray)

izolált sejtek, sejtorganellumok:

centrifugálás, szűrés, agar,alginát, fehérje

baktériumok:

agar, alginát, fehérje

tengeri élőlények:

GA és OsO 4 tengervízben oldva

5. Dehidratáció

: (min. minta V 10x) etanol aceton hasonló hatás, de aceton erősebben higroszkópos, így dehidrálás tökéletlen lehet (abs. aceton lépésnél) gyanta minősége döntő: vízoldékony – nem kell polieszter – aceton etanol, végén aceton etanol, végén sztirén epoxi – aceton etanol, végén propilénoxid

5.1 Kémiai hatás dehidratálás: minta – oldószer

5.1.1 Lipid kioldás:

akár 95% (főleg 70% felett, ill. PO) mértéke redukálható OsO 4 fixálás uranil acetát fixálás aceton használata alacsony hőmérséklet gyors munka

5.1.2 Fehérje kioldás

: kb. 4% (főleg (70% alatt, 95% - PO nincs) mértéke redukálható GA fixálás gyors munka

5.1.3 Lipid és fehérje kioldás miatt zsugorodás

– minimalizálni dehidratáció gyenge hatású artefakt képző, fixálókhoz hasonló nem kritikus lépése a munkának Lehet 0 o C-on, 4 o C-on, szobahőn – nincs igazán nagy jelentősége

5.2

Általános menete:

(15), 25, 50, 70, 90, 96(95), 100% etanol, v. aceton intermedier folyadék (pl. etanol után PO) – párolgás, tűzveszélyes 10-15 perc az egyes lépésekre (kompakt anyag, növényi minta, nagy blokk 20 perc)

idő csökkenthető:

minták mozgatása, közeg keverése szobahőmérsékleten 4 vagy 0 o C helyett oldatok cseréje kisebb blokkok (infiltráció is gyorsabb!) tárolás – éjszakára 70% etanolban (hűtőszekrényben)

szupergyors víztelenítés:

a fentieket maximálisan kihasználva így kb. 2 percre is csökkenhet a dehidratáció + 1 perc absz. etanol + 2 perc PO (3x csere!)

5.3 Részleges dehidratálás: pl. EPON 812 oldható 70% etanolban menete: 30% (15’), 70% (30’), 70% (30’) 1:1 70% etanol és EPON 812 keverék (30’) beágyazó EPON 812 szobahőmérsékleten (60’) beágyazó EPON 812 37 o C (30’) polimerizáció

5.4 Etilén glikol: fixálás nélküli víztelenítés nem okoz jelentős konformáció változást (immunológiai, citokémiai alkalmazás) PEG 200 is használható menete: 5 ml 10% etilén glikol 50% fölé növelni 5 perc alatt (cseppenként 7 ml etilén glikol hozzáadás, rázatás, szövet átlátszó lesz) további víztelenítés (2-3 perc tiszta e.g.-ban) a minta 4 o C-on eltartható tiszta etilén glikolban, abból közvetlenül átvihető: hidroxipropil metakrilátba epoxi gyantába

poliészter gyantába nem!

lipid vesztés van! (70% e.g.-ban GA és OsO 4 véd) zsugorodás és destrukció van

5.5 Intermedier folyadék: I.

etanol, propilén oxid szerepe: intermedier dehidratáló infiltráció közege infiltráció: cc. PO + gyanta (1:1) (fokozatosabb átmenet 2:1, 1:1, 2:1) II.

infiltráció dehidratálás közben: 20 és 40% PO vízben 70% vizes PO + EPON 812 (1:1) 90% vizes PO + EPON 812 (1:1) 100% PO + EPON 812 (1:1) tiszta EPON 812