Transcript M2 csoport_ eloadas_tenyleg

ELVÁLASZTÁS TECHNIKA
Labor beszámoló
M2 csoport
Bartus Zsuzsanna
Fodor Melinda
Mahunka Marietta
Marosi Dóra
Németh Viktória
Szabados Ádám
Szabó Dávid
Takács Mónika
Troczkis Fruzsina
HS-GC-MS
HS-GC-MS
PerkinElmer HS-GC-MS
Gőztéranalizátor (headspace) – mintaadagolás
 Gázkromatográf – elválasztás
 Tömegspektrométer - detektálás

GŐZTÉRANALIZÁTOR (HS) - MINTATARTÓ
• Minta (folyadék, szilárd)- és
Gázfázis közt egyensúly alakul
ki
• Az egyensúly eltolódását a
gőztér hőmérséklet
változtatásával (termosztálás)
tudjuk befolyásolni
• Egyensúly beállta után véges
térfogatot bocsájtunk a
gázkromatográfba
KIEGYENSÚLYOZOTT NYOMÁSÚ
MINTAADAGOLÁS (BALANCED PRESSURE)
•
•
•
•
d=0,2-0,3 mm, kicsi holttértfogat, elhanyagolható zónaszélesítő
hatás
Minta térfogat nagysága a ∆p-től és adagolási időtől függ
Zárt, minden részében jól termosztált rendszer
Paraméterek könnyen kontrolálhatók, jól reprodukálható mérések
GŐZTÉRANALIZÁTOR – BEÁLLÍTANDÓ
PARAMÉTEREK ÉS FŐBB HATÁSAIK
Gőztér hőmérséklete (max 400°C): megoszlási
hányados
 Termosztálási idő: megoszlási hányados
 Tű hőmérséklet: kondenzálás
 Átvezető cső hőmérséklete: kondenzálás
 Nyomás alá helyezés ideje: mintatérfogat,
kapilláris
 Injektálási idő: mintatérfogat

GÁZKROMATOGRÁFIA







Kromatográfia: fizika-kémiai elválasztási módszer,
ahol az elválasztandó alkotók 2 fázis közt – álló és
mozgó – oszlanak meg a különböző mértékű
kötődéseik szerint
Gázkromatográfia: gáz halmazállapotú mozgófázis
Kolonna töltete/belső bevonata lehet az állófázis
Gázok és gőz halmazállapotúra hozható folyadékok
vizsgálatára alkalmas
Az elválasztás nagyszámú szorpciós-deszorpciós
lépésen keresztül történik
Az elválasztás függ a vivő gáztól (Hidrogén, Nitrogén,
Hélium)
MS-nél Héliumot alkalmaznak a nagy ionizációs
energiája miatt
GÁZKROMATOGRÁFIA
•
Két kolonna típus:
töltött kolonna: töltet lehet szilikagél, aktív szén,
diatómaföld…stb., 2-4 mm belső átmérő, 0,3-3 m
hossz
– kapilláris kolonna: belső folyadék film bevonat lehet
metil-szilikon olaj, fenil-metil-szilikon olaj…stb.,
0,10-0,53 mm belső átmérő, 15-75 m hossz
–
•
Elválasztás befolyásolása:
Termosztáló hőmérséklet
– Hőmérséklet egyenletes, lineáris változtatása
– Állófázis változtatása
–
TÖMEGSPEKTROSZKÓP
•
•
•
•
Mérés elve: ionos részecskéket választunk el
fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük:
m/z) szerint csökkentett nyomáson elektromos
vagy mágneses mezők segítségével
Mérjük az elválasztott ionok intenzitását
Tömegspektrum (ujjlenyomat)
Minőségi információ: legintenzívebb ion
intenzitásra normált karakterisztikus
tömegspektrum
LEGFONTOSABB KÉSZÜLÉKELEMEK
Mintabeviteli rendszerek (GC-MS)
 Ionforrás
 Analizátor
 Detektor
 Számítógép
 Vákuumrendszer
 Energiaellátó elektromos egységek

MS DETEKTOR
V +V o= Vo +Vo sin  t
+
-
U
I
+
Vo(egyenfeszültség)
kvadrupól rudak
A
IM
minta
-6
10 - 10-8 kPa
TMSz
R
I: elektronütközéses ionforrás
IM : ionsokszorozó detektor
TMSz: turbomolekuláris szivattyú
,
vagy diffúziós szivattyú
R : olajrotációs (elõvákuum) szivattyú
V: váltófeszültség
A: analizátor
ELŐNYÖK

összetett elegyek minőségi és mennyiségi
elemzése rövid idő alatt (20-30 perc) elvégezhető,
s igen kis mennyiségű alkotók (10-15-10-21 g)
meghatározása lehetséges
Minőségi,szerkezeti információ (hogyan?):
 Referencia anyagot kell használni
 a mérés során kapott tömegspektrum és ismert
vegyületek, ismert tömegspektrumainak az
összehasonlítása,
 a mérés során kapott tömegspektrum
"megfejtése", ismert szabályok alapján történő
értelmezése

SCANFUNKCIÓK
•
Pásztázó:
az egész m/z tartományra történő ionintenzitás mérés
– A különböző m/z pontoknál mért intenzitások egymáshoz
való arányát is lehet látni → minőségi információ
– Dinamikus üzemmód,pillanatnyi ionáramot mér,nagyobb
hibával jár
–
•
SID:
Különböző, kevés m/z pontokban történő ionintenzitás
mérés
– Legalább 2 pontban kell mérni
– Az adott mérések csak pár m/z pontra korlátozódnak, így a
kérdéses ionokról sokkal pontosabb mérési eredményeket
kapunk → mennyiségi információ
– Kimutatási határ 1 nagyságrenddel jobb
–
FID (LÁNGIONIZÁCIÓS DETEKTOR)
kb. 2000-2500 K hőmérsékletű
hidrogén-levegő láng
A lángban a C-H kötéseket
tartalmazó molekulák, azaz a
szerves vegyületek (pl szerves
savak) fragmentálódnak és egy
részük ionizálódik
Láng fölé helyezett elektródpár
között gyenge áram folyik ionok
képződésének hatására
jel (feszültséget mér)
(mintakomponens
koncentrációjával arányos)
Standardek használata
HS-GC MÉRÉSGYAKORLAT



Mérés célja:
Melaszban lévő karbonsavak vizsgálata.
Vizsgált minták:
C2, V2
Felhasznált vegyszerek:
85%-os foszforsav, NaCl (Merck, Darmstadt), több
komponensű kereskedelmi standard (minden komponens 10
mmol/l)
GŐZTÉRANALIZÁTOR (HS) PARAMÉTEREI
Minta hőmérséklete:
 Tű hőmérséklete:
 Átvezető cső hőmérséklete:
 Termosztálási idő:
 Nyomás alá helyezés ideje:
 Injektálási idő:
 Tű visszahúzás ideje:

60 °C
100 °C
150 °C
10 perc
2 perc
0,05 perc
0,5 min
GÁZKROMATOGRÁFIÁS KÉSZÜLÉK ADATAI
Készülék:
Perkin Elmer AutoSystem XL
 Detektor:
FID
 Vivőgáz:
N2, 110 kPa
 Adagoló:
Perkin Elmer Headspace Sampler
 HS 40
 Kolonna:
VOCOL 60m x 0,53 mm x 3 μm
 Hőmérsékletprogram: 50 °C – ról 200 °C – ig
 7 °C/perc sebességgel

A STANDARDEK ÉS A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE
Légmentesen záródó 20 ml-es üvegedénybe
 bemértünk 2g NaCl-ot (kisózás), majd 1 ml
foszforsavat
 adtunk hozzá.
 Erre mértük rá automata pipettával a
standard/minta
 1 ml-es részletét. Közvetlenül ezután
 az edényt gyorsan légmentesen lezártuk.

STANDARD KROMATOGRAMJA
C2-ES MINTA KROMATOGRAMJA
V2-ES MINTA KROMATOGRAMJA
MÉRÉSI EREDMÉNYEK


A C2-es mintában azonosított komponensek:
propionsav, izovajsav, izovaleriánsav,
izokapronsav, kapronsav
A V2-es mintában azonosított komponensek:
propionsav, izovajsav, vajsav, izovaleriánsav
GYORSLC
KROMATOGRÁFIA ÁLTALÁNOSAN


Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus
elválasztási módszerek gyűjtőneve.
Közös elem: az elválasztandó komponensek az
egymással érintkező két fázis között oszlanak
meg, ezek közül az egyik áll, a másik pedig
meghatározott irányba halad.
UHPLC (UPLC)
HPLC
8x, 10x gyorsabb
 p›1200-1300 bar
 Dp‹2-3 µm; héjszerű
szemcse
 L= 3-10 cm; 2-3 mm
 0,1-0,5 µl minta térf.
 UV-VIS


p<400 bar
 Dp= 3-10 µm, porózus,
nem porózus
 L= 15-25 cm; 3-8mm
 5-200 µl
 UV-VIS
ALAPÖSSZEFÜGGÉSEK A KOLONNÁN KÍVÜLI
ZÓNASZÉLESEDÉSRE OPTIMÁLT GYORS LC ÉS
HPLC MÓDSZEREKNÉL



Kis szemcseátmérő
Kis térfogat (kisebb holttérfogat, kisebb
komponens hígulás)
Elemzési idő csökk.: L csökk., u növelése (k neminterferencia veszély)  meg kell növelni p-t
(Darcy)
Szemcse sérülése (UHPLC nagyobb nyomás)
 Kis η mozgófázis  acetonitril tartalmú (gradiens
elúció, maximumos görbe)
 H csak kis mértében nőjön u-val (függ η)
 Készülék max nyomás  sebességnövelés határa
 Nagy nyomáshőhossz-, keresztirányú hőm.-grad.
széles torzult csúcs (belső átmérő csökk.)
 belső átmérő csökk.Vr csökk. külső zónaszélesítő
hatások

KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:
van Deemter egyenlet:
 H- elméleti tányérszámmal ekvivalens
oszlopmagasság, u-mozgófázis lineáris áramlási
sebessége
 A: az oszlop geometriájának hatása (szemcsék
közti tér nem teljesen rendezett)
 B: longitudinális diffúzió (molekula áramlik a
szemcsék között)
 C: anyagátadással szembeni ellenállás

KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:

Szemcseátmérő csökkentése: élesebb csúcs,
rövidebb, kisebb átmérő
KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:
Hőmérséklet növelésével:csökken a kölcsönható
erők viszkozitása (mozgófázis), nő a mérendő
komponens diffúziós állandója. B≈DM
(molekuláris diffúziós állandó); C≈ (póruson
belüli diffúziós állandó)
 Kis szemcsén belüli átmérő, a mozgófázis áll,
csak a részecske diffúzióját vizsgáljuk.

KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:




Nyomás növelése: a szemcseátmérő csökkentés velejárója,
lamináris tartomány
Héjszerkezetű állófázis: a diffúziós úthossz rövidebb, mint egy
teljesen porózus szemcsénél.
Kolonna ellenállását csökkenteni, mozgófázis gyorsabb, nem
töltetes, hanem monolit kolonna esetén. Egy nagyságrenddel
kisebb nyomás, mint a porózus töltet esetén. Könnyebben alakul
ki nagyobb sebesség.
Nyomástartomány és az oszlopon kívüli térfogat nagyon fontos.
UPLC KÉSZÜLÉK PARAMÉTEREI






Waters Acquity, Ascentis Express Peptide ES
10 cm x 3 mm; 2,7 µm (0,5 µm tömör belső)
Gradiens elúció
Eluens (30 % B-ig mentünk fel):
A: víz+0,1 % TFA;
B: acetonitril:víz+0,1 % TFA (= 90:10)
U=0,8 ml/min, beinj.: 2 µl,
Detektálás: λ=260 nm
MÉRÉS KIÉRTÉKELÉS

Mennyi komponenst tud meghatározni?
Pc=1+tg/wb (tg= 2.5 min alatt)  Pc= 41
KORLÁTOK A GYORS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS
MÓDSZEREKNÉL
KORLÁTOK A GYORS
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREKNÉL




Azt vizsgáljuk, hogy milyen követelmények vannak
műszer oldalról nézve az elemzés gyorsaságának
növelésére.
A kromatogramon mért zónaszélesedés két fő részből
tevődik össze:
Kolonna által okozott
Kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások
Adagoló okozta zónaszélesedés σ2A
 Összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö
 Detektorcella okozta zónaszélesedés σ2Dcell
 Detektor elektronika okozta zónaszélesedés σ2Dt

σ2E = σ2A+σ2Ö+σ2Dcell+σ2Dt
 ∑σ2= σ2C+ σ2E

Az adagolóban és az összekötő vezetékben azért van zónaszélesedés, mert az
áramlás lamináris és a sebességi profil parabolikus, az egyes rétegek közötti
keveredés elhanyagolható. Azok a molekulák, amelyek a cső falához közelebb
vannak kb fele sebességgel haladnak, mint a maximumban
lévők => áramlási csúcsdiszperzió
Ehhez hozzájárul a detektorban az áramlási sebesség megváltozása: ha lassú
az elektronika, akkor nem lehetséges legalább 20 adatpont gyűjtése, amiből a
kromatográfiás csúcs analóg jele leképezhető =>változik a görbe alatti terület
és a zónaszélesség.
A zónaszélesedés összege nem lehet nagyobb, mint a kolonnán mért tizede.
σ2E=0,1σ2C
Példa
UPLC: 5 cm hosszú, 2,1 mm belső átmérőjű kolonna, 1,7 µm
szemcseátmérőjű töltet
Kolonna okozta zónaszélesedés:
σ2k=(πr2εT)2HL
UPLC:
σ2k=8,14 µm
r=2,1 cm
εT=0,5
Dp=1,7 µm
H= 3,4 µm
L=5 cm
A komponens hígulása a kolonnán kicsi és a csúcskapacitás nagy, mert
szűk a zóna, viszont a kolonnán kívüli zónaszélesedést
meghatározza.
A 10 %-os szabályt betartva a kolonnán kívüli zónaszélesedésnek 1 µl
alatt kell lennie. Ez pedig több függetlenből tevődik össze, meg kell
adni az egyes tagok járulékait:
- megengedett legnagyobb injektált térfogat Vinj=105 nl
- Detektor okozta zónaszélesedés és detektor térfogat σ 2det=20,8 µl
- összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö=1,28 µl*1280 nl
- detektor időállandó τRC=0,17 sec
Mintavételezési sebesség hatása a csúcskapacitásra és a
felbontásra:
a csúcskapacitás összefügg a kromatográfiás felbontással, így ha
a csúcskapacitás csökken, csökken a felbontás is.
Mintavételi sebesség
Csúcskapacitás
80 Hz
40 Hz
20 Hz
10 Hz
5 Hz
HPLC
61
56
44
28
16
A lassú mintavétel jelentősen csökkenti a kromatogramon látható csúcsok
számát
80 Hz
40 Hz
20 Hz
10 Hz
5 Hz
UHPLC
2,25
2,05
1,71
1,17
0,67
A gyors kolonnák nagy mintavételi frekvenciát igényelnek
A kis belső átmérőjű és rövid kolonnákhoz a hagyományos HPLC
rendszer nem, vagy csak nagy hatékonyság csökkenéssel
alkalmazható.
Rövid kolonnák alkalmazása HPLC rendszerben:
- 5 µl jelenti az adagolás felső határát
- a minta oldószerének gyengébbnek kell lenni, mint a mozgófázis
eluenserőssége
- a molekuláris formának azonosnak kell lennie a mintában és a
mozgófázisban
- az összekötő vezetékek hosszát a készülék által megadott
minimumra kell csökkenteni
Adagoláskor a kolonna elején csúcskompresszió történik =>
gradienselúciót alkalmazunk akkor is, amikor nem lép fel az
általános elúciós probléma. A kiindulási mozgófázis összetételének
olyan gyengének kell lennie, hogy a minta leggyengébben
visszatartott komponensének is nagyobb kell, hogy legyen a
visszatartása, mint 10.
Visszatartási tényező:
K= KVs/Vm=ns/nm*Vs/Vm
Vs, Vm: álló- és mozgófázis térfogata
K: megoszlási hányados
ns, nm: álló- és mozgófázisban mért mólok
száma
k>10
A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak. Az
összes komponens vándorlási sebessége lecsökken, a mintaadagolás
során a kolonna eleje koncentrálja azokat.
Vándorlási sebesség [ux=u/(1+k)] csökken.
k=10
Tizenegyed részére csökken a vándorlási sebesség, így a
komponensek szűk zónában koncentrálódnak.
Itt problémát okozhat az oldhatóság, ha a minta komponenseinek
nagyon eltérő az apolaritása vagy polaritása.
Ekkor a jobban visszatartott komponensek a gyenge eluenserősségű
mozgófázisban kevésbé oldódnak. A közel egyforma tulajdonságú
vegyületeknél a szelektivitás csökken.
AZ ELVÁLASZTÁST
BEFOLYÁSOLÓ
PARAMÉTEREK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA
A KROMATOGRÁFIÁS FELBONTÁS
ALAPÖSSZEFÜGGÉSE

Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k)
N az elméleti tányérszám (kinetikai hatékonyság),
 α a relatív retenció vagy szelektivitás
(termodinamikai hatékonyság),
 k a visszatartási tényező.


A kromatográfiás rendszerekben az elválasztás ezen
három paramétertől függ.
HOGYAN BEFOLYÁSOLJA A PARAMÉTEREK
MEGVÁLTOZTATÁSA AZ ELVÁLASZTÁST?

Deriváljuk az elválasztást megadó
Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k)
összefüggést, mindig az adott vizsgálandó
paraméter (N, α, k) szerint.
1.) ELMÉLETI TÁNYÉRSZÁM HATÁSA






ΔRs/ΔN = 1/8(N½)(α-1/α)(k/(k+1))
Egységnyi N változás  0,0144% elválasztásváltozás.
Ha a kolonnahosszat 2x-esére növeljük (pl. N = 3000ről 6000-re)  az elválasztás értéke kb. 14%-kal nő
(ha ua. a kolonna és változatlan a mozgófázis
összetétele).
Ez a hatás kismértékű, tehát a kolonnahossz
növelése csak mérsékelten növeli az elválasztást.
A nyomásesés a kolonnán közben kétszeresére nő.
Ezek az adatok k = 2-3, α = 1,1 és ΔR = 1 körüli
értékekre igazak.
Van Deemter  ha a szemcseátmérőt felére
csökk.  az elméleti tányérmagasság is a felére
csökken (Hmin és az Nmax)  N 2x-esére nő.
 A H-u görbe meredeksége annál kisebb, minél
kisebb a szemcseátmérő (N-ben nagyobb lesz a
nyereség).
 Ha 3 µm-ről 1,5 µm-re csökkentjük az állófázis
szemcseátmérőjét, akkor pl. N=1000 2500-ra nő
 kb. 26%-os növekedés az elválasztásban (ha az
egyéb paramétereket változatlanul hagyjuk). A
nyomásesés 4x-esére nő!

2.) SZELEKTIVITÁS HATÁSA




ΔRs/Δα = ((N½)/4)(1/α2)(k/(k+1))
Egységnyi változás az α-ban  közel 1000-szeres
változást okoz az elválasztási tényezőben.
A szelektivitási tényező kismértékű változása
nagymértékben növeli az elválasztást.
Folyadékkromatográfiában vagy az állófázis típusát
változtatjuk meg (állófázis hatás), vagy a mozgófázis
összetételét (mozgófázis hatás). Ahhoz, hogy a
mozgófázissal a megfelelő elválasztást tudjuk elérni,
szükséges, hogy az állófázison minimális elválasztás
elérhető legyen. A vegyületek szerkezetének
függvényében, tehát az első feladat a legnagyobb
szelektivitást nyújtó állófázis kiválasztása, csak
utána következhet a mozgófázissal az elválasztás
„finomhangolása”.
3.) VISSZATARTÁSI TÉNYEZŐ HATÁSA

ΔRs/Δk = ((N½)/4)((α-1)/α)(1/(1+k)2)
Egy egységnyi változás k-ban  kb. 8% változást
jelent a felbontásban.
 A deriváltnak maximum helye van a 2-3 k érték
körül.
 Folyadékkromatográfiában a visszatartást az
állófázis minőségével, a mozgófázis összetételével
és a hőmérséklettel tudjuk változtatni.

HŐMÉRSÉKLET

Új elválasztást befolyásoló tényező, amely a
technikai megvalósításban a legutóbbi években
jelent meg.
MONOLIT KOLONNÁK
ELEMZÉSI IDŐ CSÖKKEN, HA A LINEÁRIS
ÁRAMLÁSI SEBESSÉG NŐ!
tr=L/u(1+k)
Szemcsés tölteteknél a lineáris áramlási sebesség
növelésével egyenes arányban nő a kolonnán a
nyomásesés
 Ez monolit kolonnákra is igaz, viszont ezeknek az
áramlási ellenállásuk sokkal kisebb, mivel
porozitása a szemcsés töltethez képest sokkal
nagyobb (a kolonna térfogatának 80%-a
holttérfogat)
 Azaz ugyanolyan áramlási sebességhez sokkal
kisebb nyomásesés tartozik (~ 1 nagyságrenddel)

MONOLIT TÖLTET
ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE
Vannak szilikagél és szerves polimer alapú
monolitok.
Szerves alapúnál a mikropórusosság
elkerülhetetlen, ami szélesebb
kromatográfiás csúcsot eredményez,
valamint ezek mechanikailag kevésbé
stabilak (biopolimerek elválasztására
alkalmazzák).
Fehér rész: szilikagél alapváz (benne 10-20 nmes mezopórusok; visszatartást eredményezik)
Sötét rész: nagy átmérőjű pórusok (1-2 μm;
mozgófázis áramlás itt)
AZ ELVÁLASZTÁSI ELLENÁLLÁS
TÉRFOGATÁRAMLÁSI SEBESSÉG ÉS
NYOMÁSESÉS A KOLONNÁN
Tehát nyomásesés
szempontjából a
monolit előnyösebb,
mint a szemcsés.
Az általánosan
alkalmazott 1-2 ml/min
térfogatáramlási
sebességek 6-9 ml/min
értékre növelhetők.
ELŐNYÖK ÉS HÁTRÁNYOK






Előnyök:
Térfogatáramlási sebesség
növelhető
Az elválasztás
hatékonysága csak kis
mértékben csökken gyors
elválasztáskor
Hagyományos készüléknél
alkalmazható
Gyors elválasztások közül
ez adja a legkisebb
elválasztási ellenállást
Elemzési idő csökkenthető
a térfogatáramlási seb.
programozásával



Hátrányok:
A kolonna felületi kémiája
korlátozott- elsődlegesen
oktadecil és oktil
módosított kolonnák
kaphatók, és a normál
fázisú kromatográfiában
alkalmazott alap szilikagél
Mivel műanyag házban
van a töltet, így max. 200
bar nyomás alkalmazható
KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!