Transcript Práctico 4

PRÁCTICO N° 4
Análisis de fertilidad de los suelos
Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis
de fertilidad microbiana del suelo
Técnicas mas utilizadas
Abundancia de microorganismos
•
Biomasa total
•
Determinación de grupos funcionales (fijadores de nitrógeno, celulolíticos,
nitrificadores, amonificadores, etc.)
Actividad microbiana
•
Heterótrofa total (producción de CO2, consumo de O2)
•
Enzimas especificas( nitrogenasa, sacarosa, ureasa, amilasa)
Técnicas para determinar abundancia de microorganismos
Recuento de células totales
Método directo (visualización al microscopio, "camara de recuento")
Método por turbidez (Fotómetro)
Recuento de células viables

En medios sólidos: formación de colonias en caja de Petri (UFC)
Rango entre 30 – 300 colonias

En medios líquidos: número mas probable (NMP) Detección del
crecimiento por consumo de sustrato o formación de productos
Recuento de células viables: grupos funcionales
Grupo funcional: microorganismos que tienen procesos metabólicos semejantes,
independientemente de su taxonomía
Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales
1) Suspensión y dilución de suelo
2) Siembra en medios selectivos
3) Determinación del crecimiento (lectura)
4) Cálculo de abundancia
Análisis de grupos funcionales
2- Diluciones decimales
1 ml
1 ml
1 ml 1 ml
1 ml
1 ml
1 ml 1 ml
1- Suspensión
X g suelo
+
X ml H2O destilada
9 ml H2O
destilada
por tubo
10°
Agitar 3 minutos
10-1
10-2
10-3
10-4
Recuento en medio sólido
(Cajas Petri)
10-5
10-6
10-7
10-8
Recuento en medio líquido
(NMP)
3- Siembra de cada grupo funcional
Organismos fijadores de N
Nitrificadores
Celulolíticos
Amonificadores
ESTUFA
4- Incubación y crecimiento
LECTURA
5- Lectura y cálculos
Suspensión de suelo
Material de trabajo
Agregar 1 g de suelo en 100 ml de H2O destilada
Tapar y agitar durante tres minutos
Suspensión de suelo
Preparación de las diluciones
Flamear un porta-pipeta
Extraer una pipeta estéril
Extraer 1ml de la
suspensión de suelo
Preparación de las diluciones
Poner el ml en el tubo 10-1
Mezclar y extraer 1 ml
Poner el ml en el tubo 10-2
Continuar igual con todos los tubos
Siembra en medios específicos: Amonificadores
1 2 3 4 5 6 7 8
Diluciones: -8, -7, -6
0
Siembrar en medio con asparagina
Incubación 28-30°C, 7días
Siembra en medios selectivos: Celulolíticos
Diluciones: -5,-4,-3
1 2 3 4 5 6 7 8
0
Sembrar en medio líquido con
papel de filtro
Incubación 28-30°C, 15 días
Siembra en medios selectivos: Fijadores
Dilución: -3
1 2 3 4 5 6 7 8
0
Sembrar en medio sólido sin N
Incubación 28-30°C, 5 días
Siembra en medios selectivos: Nitrificadores
1 2 3 4 5 6 7 8
Dilución: -3,-2,-1
0
Sembrar en medio líquido con
sulfato de amonio
Incubación 28-30°C, 21 días
Siembra de grupos funcionales
Batería de grupos funcionales
•suspensión de suelo
•gradilla de diluciones
•gradilla de nitrificadores
•gradilla de celulolíticos
•gradilla de amonificadores
•caja de fijadores de N
Estufa de incubación
Síntesis del análisis de grupos funcionales
1 ml
1 ml
1 ml 1 ml
1 ml
1 ml
1 ml 1 ml
X g suelo
+
X ml H2O destilada
9 ml H2O
destilada
por tubo
10°
Agitar 3 minutos
10-1
10-2
10-3
10-4
Recuento en medio sólido
(Cajas Petri)
Organismos fijadores de N
10-5
10-6
10-7
10-8
Recuento en medio líquido
(NMP)
Nitrificadores
Celulolíticos
ESTUFA
LECTURA
Amonificadores
Lectura: Amonificadores (ejemplo)
Agregar reactivo Nessler
El color ocre detecta presencia de amonio
+++ ++- - -+
6 6 6
7 7 7
8 8 8
Contar los tubos positivos
Buscar el número en la tabla de Mc. Grady
Número característico
3
2
Número Mas Probable (NMP) = 15
1
Lectura: Celulolíticos (ejemplo)
+++ ++- - +3
3
3
4 4 4
5 5 5
Observar alteración del papel
Número característico
3
2
1
Número Mas Probable (NMP) = 15
Tipos de alteración del papel
Lectura: Fijadores (ejemplo)
(-3)
Contar colonias (entre 30-300)
Número de colonias (UFC) = 120
Lectura: Nitrificadores (ejemplo)
Agregar SO4H2 más difenilamida
El color azul detecta presencia de nitrato
+++
1
1
1
+ - +
2
2
2
- -+
3
3
Contar los tubos positivos
Buscar el número en la tabla de Mc. Grady
Número característico
3
Número Mas Probable (NMP) = 15
2
1
3
Actividades
1. Lectura de amonificadores: reacción de nessler y
manejo de la tabla de Mc.Grady.
2. Lectura de celulolíticos: observación del papel
degradado.
3. Lectura de fijadores de N: crecimiento de colonias en
caja de Petri.
Tabla de Mc. Grady
Nº Característico
NMP
Nº Característico
NMP
Nº Característico
NMP
000
‹0.3
111
1.1
222
3.5
001
0.3
112
1.5
223
4.2
002
0.6
113
1.9
230
2.9
003
0.9
120
1.1
231
3.6
010
0.3
121
1.5
232
4.4
011
0.61
122
2.0
233
5.3
012
0.92
123
2.4
300
2.3
013
1.2
130
1.6
301
3.9
020
0.62
131
2.0
302
6.4
021
0.93
132
2.4
303
9.5
022
1.2
133
2.9
310
4.3
023
1.6
200
0.91
311
7.5
030
0.94
201
1.4
312
12
031
1.3
202
2.0
313
16
032
1.6
203
2.6
320
9.3
033
1.9
210
1.5
321
15
100
0.36
211
2.0
322
21
101
0.72
212
2.7
323
29
102
1.1
213
3.4
330
24
103
1.5
220
2.1
331
46
110
0.73
221
2.8
332
110
Cálculos
Objetivo: llevar la lectura a expresarla en g de nuestra muestra
Nº de colonias
(caja de Petri)
Tubos
(NMP)
N
en 1 ml sembrado en la caja o tubo
X
en 10 ml del tubo de la dilución usada
(la más concentrada en el NMP)
X1
en 10 ml de la dilución 10°
X2
en X ml de la solución 10°
(volumen de la suspensión)
X2
en X g de suelo de la suspensión
X
en 1 g de suelo
Nº de microorganismos por g de suelo
Actividad: resolver problemas de abundancia de microorganismos.