Transcript Stáhnout

SPECIÁLNÍ PŘEDNÁŠKA
17. prosince
Bohumil Fafílek, Ph.D.
Slavo Kinský, Ph.D.
Ůstav molekulární genetiky, Praha
GENEROVÁNÍ TRANSGENNÍCH MYŠÍCH LINIÍ
A EDITOVÁNÍ GENOMU POMOCÍ TALENOVÝCH NUKLEÁZ
… následovat bude testík z předchozí přednášky
4.3.
11.2.
21.1.
Vždy středa 9:45 – 12:00, posluchárna B2
Písemný test, kombinace výběrových a volných odpovědí
6. a 7. ledna, od 9:00
Časový rozpis bude na webu katedry molekulární biologie, případné
preference na určitý čas hlaste předem.
Molekulární biologie
10.
Mutace a opravy DNA, rekombinace
(kapitola 23, 24)
MUTACE
• změny genetického materiálu daného organizmu (dědičné u potomků dané buňky)
• většina mutací není letální, ani se na fenotypu neprojeví. Některé mutace dokonce
přinášejí organizmu výhodu.
• mutace v somatických buňkách nejsou dědičné, pouze mutace v zárodečných
buňkách
• vetšina mutací je recesivních, efekt vykompenzován druhou alelou
 Každý člověk nese v genomu 75-100 škodlivých recesivních alel, z toho 8
letálních. Kdyby člověk existoval jako haploid, byl by dávno mrtvý!
 K tomu má každý člověk v genomu asi 20.000 změn, které jsou ale neškodné
 Nulová mutace – úplně chybí produkt daného genu, loss of function
 Tichá mutace – nemá vliv na funkci daného genu, bez fenotypu, např. ve třetí
pozici kodonu, v intronech, v intergenové DNA
 Substituce báze
 Inserce
 Delece
uvnitř genu nebo v regulačních sekvencích
 Inverse
 Duplikace
 Translokace
Substituce báze
bodová mutace
Missense mutace – změní kódovanou aminokyselinu v proteinu
neutrální mutace
(nahrazení aminokyselinou
s podobnými vlastnostmi)
radikální mutace
(nahrazení aminokyselinou
s velmi rozdílnými vlastnostmi, vliv
na strukturu a tím funkci proteinu)
Aminokyseliny konzervované u rozdíných organizmů budou dost možná v
aktivním místě proteinu a jejich mutace bude mít závažnější důsledky než
mutace ostatních aminokyselin.
Kondicionální mutace – efekt záleží na podmínkách, ve kterých organizmus žije
např. teplotně sensitivní mutace – projeví se jen při určitých teplotách
Mutace v melaninu, která ho
dělá aktivnějšímv chladnějších
částech těla.
Nonsense mutace – zavedení předčasného stop kodonu v mRNA
např. UCG
ser
UAG
stop
Prokaryota – protein je
syntetizován až do předčasného
stop kodonu, pak uvolněn, ale
protože většinou není správně
složený, je degradován
Eukaryota – nonsense mediated
mRNA decay, zničí se rovnou mRNA
Nonsense mutace = většinou
efekt jako nulová mutace
Delece
Efekt větší delece může
buď inaktivovat geny
nebo i jejich expresi zvýšit
(delece vazebného místa
pro represor)
Delece jedné či několika
bazí – frameshift ve
čtecím rámci nebo vliv na
splicing, vliv na vazbu
transkripčních faktorů atd.
Frameshift -1
Frameshift -2
Frameshift -3
Inzerce
Inzerce mobilního genetického
elementu (transposony,
retrotransposony), virů, nebo
chemickými mutageny či chybou
DNA polymerázy
zastavení exprese
zvýšení exprese
Inverze
Translokace
Duplikace
Spontánní mutace
chyby v DNA replikaci, spontánní chemické změny na DNA (s nízkou frekvencí, se
zvyšující se teplotou frekvence roste)
Indukované mutace
Mutageny: chemické látky, radiace, teplo
Chemické mutageny:
EMS (ethyl methane sulphonate)
•
•
alkylační činidlo, přidává ethylové skupiny bazím
pro in vivo mutagenezi živých buněk
Dusitany (NO2-)
•
•
•
přeměna aminoskupin na hydroxyskupiny
mutace 5-methyl cytosinu na thymin
pro in vitro mutagenezi plazmidů
E250 – dusitan sodný
Analogy bází
• 5-bromouracyl
• inkorporuje se do DNA během
replikace jako thymin
• existuje ve dvou flip-flop stavech, z
nichž jeden se páruje s A a jeden s G
• problém při následné DNA replikaci,
kdy slouží jako templát
Interkalační činidla
• acridine orange, acriflavin, ethidium
bromid
• vmezeří se mezi dvě báze DNA
• DNA polymeráza během replikace pak
rozezná tuto látku jako skutečnou bázi
a vloží extra nukleotid do DNA,
frameshift…
Teratogen – látka způsobující vývojové vady embryí
(buď jako mutagen nebo jinými mechanizmy)
Mutace způsobené radiací:
1) elektromagnetické vlnění s velmi vysokou frekvencí (UV)
- UV světlo má vlnovou délku 100-400nm, báze absorbují nejvíce při vlnové
délce 254nm, tvorba thyminových dimérů, problém při replikaci
- většina UV ze slunce zachycena ozonovou vrstvou, pokud není poškozená…
Thyminové
diméry
thymin
thyminový dimer
2) ionizační záření (X-ray, g-ray)
- přímé poškození DNA = reakcí záření s DNA (hlavně ds zlomy)
- při styku s vodou či jinými látkami indukují tvorbu iontů a volných radikálů
(hlavně OH.) = nepřímé poškození DNA
SPONTÁNNÍ MUTACE
Mutace vzniklé chybami DNA polymerázy
• proofreading aktivita DNA polymerázy není dokonalá, s malou frekvencí zůstávají
behěm replikace v DNA chyby
• u E.coli behěm replikace leading strandu zařadí polymeráza průměně 1 špatnou
bázi z 10 milionů zreplikovaných, u lagging strandu 20x více (protože DNA PolI má
má horší proofreading aktivitu)
• navíc může docházet i k ‘uklouznutí’ polymerázy (polymerase slipping):
zavedení delecí nebo inzercí
Mutace kvůli párování podobných úseků DNA a následné rekombinaci
přímé repetice na DNA
rekombinace (mezi dvěma
totožnými nebo velmi
podobnými sekvencemi)
DELECE a DUPLIKACE
DELECE
obrácené repetice na DNA
INVERZE
Mutace kvůli tautomerizaci bazí
• každá báze existuje jako keto a enol forma – tautomery
• ve vzájemné rovnováze, ale značně převažují keto formy
• pokud při replikaci báze zrovna v enol formě, bude zařazena v nesprávném párování
Mutace kvůli spontánní chemické instabilitě bazí
A, G a C mohou pomalu spontánně ztrácet své aminoskupiny = DEAMINACE
100 bazí za den v každé
eukaryotní buňce!
záměna C za T
Cytosin je horkým místem
mutací v DNA !
deaminace G a A
mnohem vzácnější
Mutace kvůli spontánní chemické instabilitě bazí
A a G se mohou spontánně hydrolyzovat od DNA kostry = DEPURINACE
5000 bazí za den v každé
eukaryotní buňce!
Poškození oxidativním stresem (volnými radikály, např. během buněčného metabolismu)
Formace 8-oxoguaninu
(= 8-hydroxyguanin)
párování s A
záměna G/C za A/T
Poškození neenzymatickou metylací
S malou frekvencí může donor
metylačních skupin (S-adenosyl
methionin) spontánně metylovat
báze
adenin
3-methyladenin
OPRAVY DNA
Prokaryota
Proofreading aktivita DNA polymeráz se snaží
eliminovat špatné párování během replikace
Mismatch v párování bazí, jejich chemické modifikace
nebo výskyt analogů bazí vede k distorci DNA
Mismatch repair system a excision repair system
detekují tyto změny struktury DNA spíše než
specifické chemické změny
Jak reparační systémy poznají, která ze dvou
nesprávně spárovaných bazí je ta správná?
Jak reparační systémy poznají, která ze dvou
nesprávně spárovaných bazí je ta správná?
Je třeba umět rozeznat při replikaci parentální DNA vlákno od nově replikovaného
Bakteriální DNA metylázy metylují parentální vlákno DNA
dam (DNA adenine methylase) - GATC
dcm (DNA cytosine methylase) – CCAGG nebo CCTGG
6-methyladenin a 5-methylcytosin se párují správně, neindukují reparační odpověd’
několik minut po replikaci je nová
DNA šroubovice hemimetylovaná
nastupují reparační enzymy a hledají
chyby v nemetylovaném vlákně
dam a dcm metylázy metylují i nové
vlákno
DNA mismatch repair system
(MMR system)
rozpoznání chybné báze pomocí MutL ,
MutS a MutH proteinů
zavedení zlomu v novém DNA vlákně
odstranění úseku DNA kolem chybného párování
dosyntetozování správné báze DNA
polymerázou III (nebo d u eukaryot)
Nucleotide excision repair system (NER system)
• nejčastější systém oprav poškozené DNA
• rozpoznává změny struktury DNA, ale méně
senzitivní než MMR (změny struktury musejí
být více nápadné)
• především opravy DNA poškozené UV =
thyminové dimery, kroslinkované báze
rozpoznání chybné báze pomocí uvrA,B,C
proteinů
zavedení dvou zlomů okolo T=T
odstranění úseku DNA kolem chybného párování a
dosyntetizování správné báze DNA polymerázou I
Base excision repair system (BER system)
• rozeznává specifické chemické změny v DNA, která se neprojeví na změně struktury
DNA
• opravuje báze, které se normálně v DNA nevyskytují (není pochyb o tom, že jsou
špatné)
Deaminace adeninu na hypoxantin, guaninu na xanthin, cytosinu na uracil:
DNA glykosyláza odštěpí chybnou
bázi, vznikne místo bez báze (AP
místo)
AP endonukleáza štěpí kostru DNA
DNA polymeráza I dostaví mezeru
Oxidace guaninu na 8-oxoguanin
(při oxidativním stresu):
MutT fosfatáza odstraňuje fosfátové
skupiny z volných oxoGTP nukleotidů,
aby se nemohly inkorporovat do DNA
MutM glycosyláza odstraňuje oxoG z DNA
(pokud se páruje správně s C)
MutY glycosyláza odstraňuje A z DNA
pokud se páruje s oxoG
Vzniklé AP místo dostavěné DNA
polymerázou I
Very short patch repair system
Thymin vzniklý spontánní deaminací 5-methyl cytosinu (ne během replikace DNA) je
horkým místem mutací (změna CG naTA)
• u E.coli je 5-methylcytosin hlavně v místech metylovaných dam a dcm
• pokud se T vyskytne v sekvencích rozeznávaných dam a dcm metylázami (CCAGG a
CCTGG), je odstraněn Vsr endonukleázou
Sebevražedné demetylázy
Metylové skupiny na kyslíku u O6-methylguaninu a
O4-methylthyminu odstraněny sebevražednými
enzymy, které metylovou skupinu přenesou na
sebe. Báze je tím rovnou opravena, ale enzym lze
použít pouze jednou.
Ostatní metylované báze odstraněny DNA
glycosylázami
Photoreaktivační systém
oprava thyminových dimerů (opravy také
pomocí NER systému, Uvr proteiny)
Přímá oprava, rozštěpení dimeru, bez
použití polymerázy
Fotolyáza – absorbuje viditelné světlo o
vlnové délce 350-500nm (modré) a jeho
energii používá rozštěpení thyminového
dimeru = fotoreaktivace
Opravy pomocí rekombinace
Ne všechny chyby DNA se podaří odstranit
před průběhem replikace. Pokud mutace brání
postupu DNA polymerázy (například
přítomnost thyminových dimerů), polymeráza
odpadne a začne syntézu opět o kousek dál
Vznikne jednořetězcová mezera
v replikovaném chromozomu
RecA
Rekombinace mezi ‘zdravým’ vláknem na
druhém chromozomu a vláknem s mezerou
Mezera dostavena podle zdravého vlákna,
thyminový dimer sice neopravený, ale oba
chromozomy zreplikovány bez mezer
SOS reparační systém
Pokud je DNA poškozená na mnoha místech a během replikace vzniká hodně
jednovláknových oblastí, SOS systém umožní průběh replikace dosyntetizováním
těchto úseků, i když to pravděpodobně zavede mnoho mutací
RecA se
aktivuje
vazbou
na ssDNA
RecA rozštípe
LexA represor
lexA dimer blokuje
expresi SOS genů
lexA je zničen,
spustí se exprese SOS genů
Pouze u bakterií, pro Eukaryota příliš nebezpečné replikovat buňky s
mnoha mutacemi (rakovina), raději apoptoza nebo inhibice dělení
např. DNA polymeráza V,
nemá proofreading activitu,
takže můž replikovat i
thyminové dimery a místa
bez bází (AP místa)
Oprava spřažená s transkripcí (transcription coupled repair)
Pokud je DNA hodně poškozená, může bránit průběhu transkripce, RNA
polymeráza se zastaví, začne oprava templátového vlákna
Bakterie:
TRCF protein rozpoznává zastavenou polymerázu
(transcription repair coupling factor)
Eukaryota:
TFIIH rozvolňuje DNA během transkripce, pokud’narazí
na poškozenou DNA, naváže proteiny excision repair
systému (NER)
Opravy u Eukaryot
Systémy podobné jako u prokaryot, ale méně prozkoumané
Mutace v reparačních genech jsou doprovázené vyšší výskytem rakoviny:
hMSH2 (human MutS homologue 2) – mismatch repair system, vznik
malých delecí a inzercí
BRCA1 (breast cancer A1) – zlomy dsDNA, transkripční reparace
Xeroderma pigmentosum
mutace v genech pro excision repair system,
vysoká senzitivita kůže k UV záření
Problémy s opravami DNA vedou ke zvýšené náchylnosti k rakovině a k
předčasnému stárnutí
Wernerův syndrom
Předčasné stárnutí způsobené mutací ve Wnr genu – specifické helikázy
používané při opravách DNA
DNA damage checkpoints
Při každém dělení se na přechodech G1/S a G2/M a také v S kontroluje intaktnost DNA
ATM kináza – detekuje dvojřetězcové zlomy
ATR kináza – detekuje zastavené replikační vidličky
Fosofrylují celou řadu proteinů vedoucí k zastavení buněčného cyklu nebo apoptose
např. p53
Opravy dvojřetězcových zlomů
Non homologous end joining
Zlomy dsDNA ionizačním zářením,
chemicky nebo po vyštěpení
transpozonů
eukaryota
1. Vazba Ku proteinů na konce dsDNA
2. Vazba DNA-PK (DNA protein kinasy)
3. Fosforylace XRCC4, díky tomu
navázání ligázy a spojení DNA
Může spojit omylem i DNA, která k sobě
nepatří, chromozomální translokace
dsDNA zlomy možno opravit též
homologní rekombinací (viz dále)
Horká místa mutací
Ne všechna místa v genomu jsou stejně náchylná k mutacím, některá místa mají
frekvenci daleko vyšší.
Vetšinou místa výskytu 5-methylcytosinu, který občas spontánně deaminuje na thymin
a páruje se pak s A místo s G.
Reverze fenotypu
Fenotyp vzniklý určitou mutací je vrácen do normálního stavu
Šance, že by daný nukleotid
spontánně zmutoval zpět na
původní nukleotid je velmi malá
Mnohem častěji je reverze
fenotypu způsobena jinou mutací,
která vyruší účinek první =
supresorová mutace (ať už ve
stejném genu nebo v jiném)
Supresorové tRNA
• nabité tRNA, které ale
mají zmutovaná
antikodon, takže
rozeznává STOP kodon
(např. tRNA pro glycin,
kde antikodon GAC
zmutoval na AUC)
Důsledkem je prodloužení i normálních proteinů, což
může být problém.
• Mohou částečně
obnovit expresi genů s
předčasným stop
kodonem, běžné u
prokaryot a kvasinek
• Pouze pokud existuje
více tRNA pro tutéž
aminokyselinou, jinak
by mutace kodonu
byla letální
REKOMBINACE
Rekombinace
Výměna genetického materiálu
mezi chromozomy nebo nebo
jinými molekulami DNA
U eukaryot při meioze, při
opravách DNA, u bakterií při
konjugaci plazmidu
crossing over – zlom v DNA a její
spojení s jinou molekulou
(zde dvojitý crossing over)
Homologní rekombinace - mezi dvěma velmi podobnými skevencemi
Nehomologní (místně specifická) rekombinace – mezi jinak nepodobnými
sekvencemi, ale iniciováno na krátkém úseku homologie rozpoznávaném
specifickými proteiny
Holliday junction
Crossing over dvou jednovláknových
řetězců DNA a jeho posun podél
chromozomu
Následuje další štěpení a separace
vláken, může a nemusí vést k výměně
celých ramen na chromozomu:
Holliday junction se může otáčet do
dvou izomerních stavů
Patch recombinant
Vymění se pouze část
jednoho vlákna
resolváza (rekombináza) – štěpí
a liguje DNA v Holliday junction
True recombinant
Vymění se celý zbytek
chromozomu
Crossing over / video
http://booksite.academicpress.com/Clark/mol
ecular2/anim24_crossoverformation.php
Jak se homologní sekvence najdou a spárují ?
Bakterie: zlom v dsDNA a
invaze jednořetězcového vlákna
1. RecBCD komplex nasedá na zlomy dsDNA
2. Postupuje po DNA, dokud nenarazí na
Chi sekvenci (GCTGGTGG, časté)
3. RecC odštěpí jeden z řetězců DNA
4. RecBC postupně odhaluje ssDNA s
volným 3’koncem, ta se pokrývá
RecA proteiny:
Zlomy v dsDNA = většinou ne zlomy v
genomické DNA, ale v cizorodé DNA
vniklé do buňky při transformaci,
transdukci viry, konjugaci
ssDNA vlákno s volným 3’koncem se
pokrývá RecA proteiny
… a atakuje dsDNA homologní DNA
molekuly
Dočasné vytvoření triple helixu
Vytěsněné ssDNA vlákno se pak spojí s
ssDNA druhé molekuly
Místně specifická rekombinace
(nehomologní)
Pouze krátké místo homologie mezi
dvěma jinak rozdínými molekulami;
pro rekombinaci musí být toto místo
rozpoznáno specifickými proteiny
např. integrace bakteriofágu lambda
do chromozomu E.coli
attP místa v bakteriofágovi, attB místa
v bakterii, pouze oblast attO je uplně
homologní
Integráza z bakteriofágu štěpí dsDNA
Eukaryota
Rekombinace především během meiozy
Musí se zavést zlomy v dsDNA = riskantní!
Rekombinace během mitózy – k opravě zlomů v dsDNA nebo jednovláknových
mezer v dsDNA
Mechanismus podobný jako u bakterií
Spo11 štípe dsDNA
nukleázy odstraní ss
vlákno a nechají vlákno s
3’koncem, pokrývá se
Rad51 proteinem (jako
RecA)
atak homologních úseků…
Genová konverze během meiozy
Dvě alely téhož
genu, R a r
rekombinace
DNA během
meiózy
Přeměna jedné alely genu v druhou
během rekombinace a následné pravy
DNA
Pokud meioza proběhne před opravou
DNA, vytvoří se normálně dvě R a dvě r
Jinak ale reparační systémy opraví
DNA náhodně, buď podle jedné alely
nebo podle druhé
Někdy se DNA opraví tak, že
vzniknou 4 alely téhož genu, druhá
alela zanikne
r,r,r,r
R,R,R,R
PŘEDNÁŠKA
17. prosince
Bohumil Fafílek, Ph.D.
Slavo Kinský, Ph.D.
Ůstav molekulární genetiky, Praha
GENEROVÁNÍ TRANSGENNÍCH MYŠÍCH LINIÍ
A EDITOVÁNÍ GENOMU POMOCÍ TALENOVÝCH NUKLEÁZ