Transcript identifikacija gljiva antimikogram

Cilj nastave:
1.






Principi LDg PGI:
dlake
nokta
kože
sluzokože
oka
uva
3. Metode
identifikacije gljiva
Metode ispitivanja
osetljivosti gljiva na AM
 Difuzija
 Dilucija
 Etest
2. Principi




4.
LDg IGI:
aglutinacija, precipitacija,
ELISA, PCR, PH
invazivna aspergiloza (IA)
invazivna kandidijaza (IC)
zigomikoze
Pneumocystis pneumonija
Epidemiologija GI
Rizične grupe pacijenata
Endemske GI
(bifazne i subkutane mikoze)
Mikoalergeni i mikoalergoze
Mikotoksini i mikotoksikoze
Metode identifikacije gljiva:
Identifikacija i karakterizacija izolovanih gljiva vrši se na osnovu:

Makroskopskih kulturalnih karakteristika

Mikroskopskih kulturelnih karakteristika (preparat sa SDA, HA, PDA, DTM, MSIA)

Specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama (GACA)

Fizioloških karakteristika (germinacija, produkcija ureaze, kapsule...)

Biohemijske identifikacije (API, Candida Chrom Agar...)

Odredjivanja antigenske gradje izolovanih gljiva (npr. LA)

Odredjivanja DNK sekvenci karakterističnih za vrstu (npr. PCR)

Odredjivanja faktora virulencije (detekcija enzima, mikotoksina...)

Odredjivanja rezistencije na AM (rezistotipija)
Na osnovu specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama
(GACA razlikovanje C. neoformans od Candida; kukuruzni agar hlamidospore formira samo C. albicans)
Na osnovu fizioloških karakteristika
(germinacija karakterstika C. albicans; produkcija kapsule karakteristika C. neoformans)
Na osnovu biohemijskih karakteristika
(API sistemi za fermentaciju i asimilaciju; podloge sa hromogenim suptancama Chrom-agar)
Hrom agar – IDENTIFIKACIJA kvasnica
C. tropicalis
C. glabrata
C. albicans
C. krusei
Biohemijska karakterizacija
IDENTIFIKACIJA kvasnica
Identifikacija i ispitivanje njihove osetljivosti Candida
Biohemijska identifikacija kvasnica
Biohemijska serija ID32
(bioMerieux, Paris)
UNI-YEAST-TEC PLATE
API ZYM - enzimska karakterizacija gljiva
C. parapsilosis
C. dubliniensis
ANTIMIKOGRAM I ANTIMIKOTICI
Zbog čega antimikogram?
•
Ozbiljan i često loš klinički tok i prognoza IGI, RVVK i sl.
•
Promenjen empirijski koncept lečenja gljivičnih infekcija zasnivan na
pretpostavci da su gljive generalno osetljive na antimikotike (AM)
•
Toksičnost i druga neželjena dejstva AM i ograničena primena
•
Veći izbor AM, posebno za parenteralnu primenu
UPOTREBA AM:
 Profilaksa
 Empirujska th
 “Pre-emptive” th
 Specifična th
Metode ANTIMIKOGRAMA:
 Difuzija
 Dilucija
 Etest
Ciljne strukture gljiva i mehanizmi dejstva AM
Membrane function:
Amphotericin B
Cellwall synthesis:
Echinocandins
Ergosterol synthesis:
Azoles
Razvoj AM
# broj lekova
14
12
10
8
6
4
5-FC
2
L-AmB
ABCD
ABLC
Terbinafine
Itraconazole
Fluconazole
Ketoconazole
Miconazole
0
1950
1960
1970
1980
1990
2000
Metode antimikograma
Difuzioni metod
Dilucioni metod
24-48 h
48 - 72 h
Kombinovani metod (E test)
48 h
Automatski sistemi – identifikacija i AM
> 24 h
Disk difuzija, Etest i mikrodilucioni metod
Bujon dilucioni metod
suspenzija
100 µl
0,5
0,25
0,125
37°C
MIK: najmanja
koncentracija AM koja
inhibira porast gljiva
(bujon ostaje bistar)
MIK
37°C
MFK
24 h
0,06
0,03
Bujon
+
AM (µg/ml)
24 h
MIK = 0,25 µg/ml
MFK: presejavanjem svih
razblaženja koja inhibiraju porast
gljiva
MFK = 0,5 µg/ml
Kombinovani metod - E test
• Zasniva se na principu difuzije AM kroz čvrstu hranljivu
podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom kulturom
• Opadajući gradijent koncentracije AM na traci E testa
E
12
8
4
3
2
1.5
1
.75
.50
.35
.25
.10
.05
.02
.01
E
37°C
24 h
Plastična traka impregnirana
AM u gradijentu
koncentracije
12
8
4
3
2
1.5
1
.75
.50
.35
.25
.10
.05
.02
.01
Zona inhibicije
elipsa
MIK
REZISTENCIJA GLJIVA NA AM
REZISTENCIJA:
odsustvo terapijskog efekta primenom odgovarajućih terapijskih doza AM
Klinička rezistencija
Primarna (unutrašnja)
prisutna i pre izlaganja tj. kontakta gljive sa
AM (genetski predodredjena -spontatne
mutacije)
Sekundarna (stečena)
- razvila se u toku/ posle primene terapije
- rezultat genotipskih i fenotipskih promena
indukovanih antimikotikom
Otpornost na doze hemioterapeutika koje
se postižu pri optimalnim/ maksimalno
dozvoljenim terapijskim dozama
(toksičnost!)
Za sve izolate gljiva iz primarno sterilnih
regija – OBAVEZAN je antimikogram
MEHANIZMI REZISTENCIJE GLJIVA
1. Prekomerna produkcija ciljnog enzima
2. Izmena ciljnog mesta
3. Efluksne pumpe
4. Sprečen ulazak
5. Zaobilazni metabolički putevi
6. Inhibicija enzima aktivatora leka
7. Degradacija leka EC enzimima
NAJČEŠĆE VRSTE GLJIVA I OSETLJIVOST NA AM
█ > 75% senzitivnost, █  50%, █ < 5%;
(O'Brien et al., ASH Edu 2003)
Vrste gljiva
C. albicans
C. parapsilosis
C. tropicalis
C. glabrata
C. krusei
A. fumigatus
A. flavus
A. terreus
Zygomycetes
Fusarium spp.
AmB
Fluconazol
Itrakonazol
Vorikonazol
Caspofungin
5-FC
Savremena terapija i značaj laboratorijske dijagnoze
Empirijska
Profilakticka
4
Temperature (°C)
Terapija
Pre-emptive
1
40
39
38
CT
37
36
Granulocytes (log10x109/L)
PCR +
Antigeni
10
Verovatnoća
IGI
Specificna
0
Moguca
Rizik
+
Kultura +
Tkivo +
Verovatna
Dokazana
1
0.1
-14
-7
0
7
14
21
28
35
Dani posle transplantacije
42
49
56
63