Transcript INDICADORES METODOS ANALITICOS

COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP

El grupo Coliforme queda definido como los bacilos Gram
negativos aerobios o anaerobios facultativos , no
esporulados que fermentan la lactosa con producción de
ácido y gas en un tiempo máximo de 48hs a 35 ± 05°C

Los datos son reportados en términos de NMP de
organismos presentes. Basados en fórmulas de probabilidad
da una estimación de la densidad media de Coliformes
presentes en la muestra, que puede representarse como:
NMP = µ + e
m
+ea
Donde µ es la verdadera cc promedio de la masa de agua,
em error de estimación debido al muestreo y ea el error
debido a la determinación analítica

La precisión dependerá del número de tubos usados.
Cuando se aplica a calidad de agua de bebida se
recomienda el uso de réplicas de 10 tubos con 10ml de
muestra, 5 tubos con 20ml de muestra o bien, un sólo
frasco con 100ml
COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP

Las réplicas de tubos a sembrar se definen de acuerdo a la
precisión, límites de detección requeridos y sospecha de
contaminación bacteriana de la muestra:

Para agua cruda superficial, líquido residual cloacal,
biosólidos se siembran tripletes de tubos de 1ml de
diluciones decimales seriadas de la muestra

En caso de muestras de lagos, vertientes donde se
presumen recuentos bacterianos más bajos se siembran
réplicas de 5 tubos de 1ml de diluciones seriadas de la
muestra

La densidad de Coliformes se expresa en términos de NMP
(NMP/100ml), en el caso de biosólidos se expresa como
NMP / gramo de materia seca
COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP

El test comprende tres
etapas: presuntiva,
confirmatoria y
completa.

Todos los tubos positivos
que presenten
crecimiento con
producción de ácido y/o
gas pasarán a la fase
confirmatoria. El test
completo se aplicará a
no menos del 10% de las
muestras positivas de un
trimestre.
COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP

Etapa presuntiva: se siembran en
caldo Lauril sulfato-triptosa (LTB),
luego del período de incubación se
revisan los tubos por presencia de
ácido y/o gas

Todos los tubos positivos pasarán a
la fase confirmatoria: de cada tubo
efectuar repiques a tubos con caldo
Lauril sulfato-triptosa (LTB) para
confirmación de Coliformes totales
y a tubos con caldo EC-triptófano
para diferenciación y confirmación
de Escherichia coli
COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP
COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP
Caldo Lauril Triptosa (+)
producción de ácido y/o gas
(48 ± 3hs a 35 ± 0.5°C)
Coliformes totales
Presuntivos
Caldo Bilis Verde Brillante (+)
Caldo EC (+)
producción de gas
Indol (+)
(48 ± 3hs a 35 ± 0.5°C)
(24 ± 2hs a 44.5 ± 0.2 °C)
Coliformes totales
Confirmados
Escherichia coli
Confirmada
COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP
COLIFORMES TOTALES: TECNICA POR NMP
N° tubos
positivos
3 tubos
seriados
de 1ml
NMP
/100ml
N° tubos
positivos
5 tubos
seriados
de 1ml
NMP
/100ml
N° tubos
positivos
5 tubos de
20ml
NMP
/100ml
N° tubos
positivos
10 tubos
de 10ml
NMP
/100ml
1
40
1
20
0
<1.1
1
1.1
11
70
11
40
1
1.1
3
3.6
2
90
2
50
2
2.6
5
6.9
333
24000
555
24000
3
4.6
7
12
3332
110000
5552
54200
4
8.0
9
23
33333
2400000
55555
2400000
5
>8.0
10
>23
METODO DE PRESENCIA / AUSENCIA






Es una simplificación del test de NMP que usa una sola
porción de 100ml para obtener información cualitativa
Puede ser usado como base cualitativa de otros
indicadores:
Clostridios,
Pseudomonas,
Coliformes
Termotolerantes
En el caso de Coliformes consta de una fase presuntiva
donde se siembran 100ml de muestra de caldo P/A (triple
concentración) Luego de la incubación las condiciones de
acidez por fermentación de la lactosa da un color amarillo
distintivo y por agitación el gas produce espuma
La fase confirmatoria incluye confirmación para Coliformes
totales, fecales y E coli
Los resultados se reportan como test P/A positivo o
negativo por 100 ml de muestra
Cuando una muestra da positiva es recomendable
determinar las densidades de Coliformes en repeticiones
para obtener información de la magnitud del evento
COLIFORMES TOTALES: MEMBRANA FILTRANTE

A los fines de esta técnica el grupo Coliforme se define como
bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos , no
esporulados que producen aldehídos de la fermentación de la
lactosa y brillo metálico en la superficie de las colonias

Membranas: lámina rígida , uniforme de material polimérico
(acetato o nitrato de celulosa) con un tamaño de poro
determinado (en general,0.45 u) que retiene partículas en su
superficie

Ventajas: es altamente reproducible, puede ser usada para
procesar grandes volúmenes de agua dando resultados numéricos
en menor tiempo que el NMP

Limitaciones: muestras de agua con alto contenido de material
particulado, la retención de partículas está limitada a la
superficie del filtro, altas densidades de bacterias no-Coliformes
que pueden interferir con el máximo desarrollo de Coliformes

Incubación: 22 a 24hs a 35 ± 0.5 °C La diferenciación de algunas
colonias puede perderse si se incuba más de 24hs
COLIFORMES TOTALES: MEMBRANA FILTRANTE

Confirmación/ Verificación: para agua de bebida verificar
como mínimo 5 colonias típicas y 5 atípicas de muestras
positivas, en caso de no obtener positivos analizar una
muestra positiva de origen conocido trimestralmente

Test confirmatorio: gas a partir de LTB y BGLB (35±0.5°C,
48hs) La inoculación en caldo EC (44.5±0.2°C, 24hs)
revela la presencia de Coliformes Termotolerantes y el
EC-MUG(44.5±0.2°C, 24hs) la presencia de E coli

Test verificación rápidos: citocromo oxidasa(-)y ß
galactosidasa o sistemas multi-test para Enterobacterias

Cálculo y expresión de resultados: computar recuentos
entre 20-80 colonias y no más de 200 colonias.

Medios de cultivo: m-ENDO Agar Les o m-ENDO Broth,
Tergitol-7, Coli ID, Chromocult Agar, m-Lauril Sulfato
Broth, Cahpman TTC Agar
METODO DE PARTICION PARA E COLI





Un método rápido es pasar la membrana con Coliformes
totales o fecales a un agar nutritivo con el sustrato MUG
En este caso E coli se define como el Coliforme que
produce la enzima ß-glucuronidasa e hidroliza el sustrato
MUG (4-metil umbeliferil-B-D-glucurónido) para producir
fluorescencia azulada alrededor de la colonia
La incubación se realiza a 35 ± 0.5 °C durante 4hs y se
observan las colonias fluorescentes bajo lámpara UV
(366nm)
Se puede optar por caldo EC-MUG (44.5 ± 0.2°C,24hs) y
observar la fluorescencia bajo lámpara UV
Agregar un control de medio de cultivo por
autofluorescencia y un control positivo (E coli, MUG +) y
uno negativo (Klebsiella penumoniae, MUG-)
Comparación de dos métodos de ensayo más utilizados en
la vigilancia de la calidad microbiológica del agua
Técnica de tubos múltiples
Técnica de Filtración por membrana
Más lenta, requiere 48 horas para observar la
positividad
Más rápida, resultados cuantitativos o presuntivos
alrededor de 8 horas.
Más laborioso
Menos laborioso
Requiere más medio de cultivo.
Requiere menos medio de cultivo
Requiere más cristalería
Requiere menos cristalería
Menos sensible
Más sensible
Los resultados son obtenidos indirectamente por
aproximación estadística (baja precisión)
Los resultados son obtenidos directamente por
conteo de colonias (alta precisión)
No se puede adaptar a trabajo de campo
Capaz de ser adaptado en el campo
Aplicable a todo tipo de agua
No es aplicable a aguas turbias
Los recursos están disponibles en la mayoría de los
países
El costo de los recursos es alto en algunos países
Podría ser mejor la recuperación de microorganismos dañados o estresados en algunas
circunstancias
Para recuperación de organismos estresados se
usan medios de resucitación
COLIFORMES TOTALES: MEMBRANA FILTRANTE
Agar m-ENDO Les
Coliformes
Totales
Agar Nutritivo + MUG
Lámpara UV
Escherichia coli
RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES

El recuento en placa de las bacterias con incubación
aeróbica a 22 y 37°C representa el número de bacterias
totales seleccionadas según: el medio de cultivo,
temperatura y tiempo de incubación.

ISO 6222: propone la supresión de glucosa del medio de
cultivo (medio menos rico en nutrientes) y modifica las
condiciones de incubación: 36± 2°C (44±4hs) y 22± 2°C (68±
4hs)

IRAM 29122: traducción de la ISO 6222

SM 9215 B: plantea el uso de PCA (altos nutrientes) sólo
para comparaciones o continuidad con los datos antiguos ya
adquiridos y recomienda el uso del R2A o HPCA agar.
Incubación: 48hs a 35°C
PSEUDOMONAS AERUGINOSA: METODOS

Membrana filtrante: SM 9213 E propone el uso del M-PA-C
agar, incubación a 41.5±0.5°C por 72hs y confirmación en
Milk Agar (35±1.0°C, 24hs) de un número de colonias típicas
y atípicas

La norma francesa NFT 90-421 propone el Agar Cetrimida
suplementado con ácido nalidíxico como medio selectivo
(37±1°C, 48±3hs) y observación de fluorescencia (por la
producción de un pigmento azul-verdoso fluorescente) bajo
lámpara UV. Confirmación crecimiento en Agar Nutritivo
(42±0.5°C, 24hs)

Método por NMP: SM 9213F propone el uso del caldo
Asparagina (35 a 37°C, 24 a 36hs) para la etapa de
enriquecimiento y caldo Acetamida (35 a 37°C, 24 a 36 hs)
para la etapa de confirmación
ENTEROCOCOS: METODOS




Membrana filtrante: NF EN ISO 7899-2, emplea el medio
de Slanetz Bartley (37±1°C,48±3hs) que contiene azida de
sodio y reduce el cloruro de trifenil-2,3,5- tetrazolium a
formazán
(coloración roja) y confirmación por
transferencia de la membrana en forma invertida en agar
BEA (azida bilis esculina) (44 ± 0.5°C, 30min) dando
colonias negras por hidrólisis de la esculina
Medios
de
cultivo:
m-Enterococcus
agar,
KF
Estreptococcus agar, D-coccosel, Chromocult Enterococos
agar
Por NMP: NFT-90-411, enriquecimiento en caldo azida
dextrosa (37±1°C, 24-48hs) y confirmación en agar bilis
esculina (37±1°C, 24-48hs)
Medios de cultivo: Caldo Azida Dextrosa, Caldo Rothe,
Caldo EVA, Caldo Azida Glucosa
ENTEROCOCOS: METODOS
Agar Chromocult
m-Enterococos Agar
CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: METODOS

Membrana filtrante: ISO 6461/2, eliminación de las formas
vegetativas por calentamiento en baño de agua a (75± 5°C, 15
min),
filtración
por
membrana
de
0.2µm
,para
aguas
contaminadas filtrar 10ml y ajustar diluciones. Incubar en
condiciones de anaerobiosis (37±1°C, 20±4hs y 44±4hs), si esto no
es posible informar resultados de (20±4)hs, se observarán
colonias con halo negro por reducción del sulfito de sodio a
sulfuro y combinación con la sal de hierro (citrato de hierro)

Medios de cultivo: SPS agar, m-CP agar, TSC agar, Triptosa
Sulfito Cicloserina agar, Sulfito Iron Base agar

Por NMP: EN 26461/1, calentamiento por 15 min de la muestra y
enriquecimiento
en
caldo
DRCM
(Diferential
Reinforced
Clostridial Broth)y anaerobiosis por agregado de capa de vaselina
al tubo, incubar (37±1°C, 44±4hs) se consideran positivos los
tubos con precipitado negro.
CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: METODOS
NMP: Caldo DRCM
Membrana filtrante: Agar SPS
Métodos Enzimáticos para la detección de Indicadores
Utiliza los sustratos hidrolizables para la detección simultánea de
enzimas de E. coli y Coliformes totales y también Enterococos
 Disponibles en formato P/A, NMP o en multiplaca. Según el principio
que utilice será la coloración final del reactivo :
Enterolert®, IDEXX (Manafi, 1996), Colisure®, IDEXX (Mc Feters, 1995)
Colilert®, IDEXX (Edberg, 1991 y 1998), m-Coliblue®, Hach
ColiComplete®,BioControl Chromocult®, MerckMicroSure®, Gelman,
Colifast
Coliformes
Totales
Reactivo
+
Escherichia
Muestra
coli

Sustancias Cromogénicas disponibles para la detección de
bacterias indicadoras
Bacteria
Coliformes
E coli
Enterococos
Sustancia cromogénica
Enzima
testeada
o-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido (ONPG)
 6-bromo-2-naftil-ß-D-galactopiranósido
 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-Dgalactopiranósido (XGAL)
ß-Dgalactosidasa
5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-Dglucurónido (XGLUC)
 4-metilumberlliferil-ß-D-glucurónido
(MUG)
ß-Dglucuronidasa


4-metilumberlliferil-ß-D-glucósido (MUD)
 indoxil-ß-D-glucósido

Fuente: Adaptado de Manafi (1996)
ß-Dglucosidasa