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抗体芯片 Antibody Microarrays 蛋白芯片 蛋白质芯片是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微 阵列。 蛋白芯片技术的基本原理: 将各种蛋白质有序地固定 于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上，然后，用标 记了特定荧光的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂 将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利 用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各 点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之 间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的 目的。 固定在芯片上的蛋白可以是：抗原、抗体、小肽、受 体和配体、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA复合物等。 分类： 蛋白功能芯片----天然蛋白点加在基片上，了解体 系中哪种蛋 白能与已知的某种蛋白结合，用于天 然蛋白活性及分子亲和性研究。 蛋白检测芯片---- 将具有高度亲和特异性的探针 分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用于识别复 杂生物样品中的目标蛋白/多肽。 蛋白芯片较之传统分析方法主要有以下优点: (1)蛋白芯片上可以实现成千上万个蛋白质样品的高通 量平行分析, 一次实验可提供大量数据-----高通量; (2)有高的信噪比，高准确性、高灵敏度; (3)所需样品量极少----微量化; (4)在整个基因组和蛋白质组水平将ＤＮＡ序列信息与 蛋白质产物直接联系起来。 (5)快速、微型化和自动化。 应用： 1.基因表达产物的筛选——德国Lueking 2.病变细胞中分子标记蛋白的研究 对病原微生物的检测—— Rowe 对肿瘤的诊断—— Englert 3.分子相互作用研究： 抗原/抗体相互作用研究， 酶与底物相互作用研究， ＤＮＡ、ＲＮＡ及小分子与蛋白质相互作用研究 蛋白芯片平台包括：芯片制造、处理、表面化学、检 测试剂、扫描和分析 该系统适用于多种蛋白检测，包括：多样品微量免疫 测定、蛋白质-抗体、抗体-蛋白质、抗体-抗原、蛋白 质-蛋白质和蛋白质-药物的检测。 生物芯片技术的核心是生物芯片的制备及反应信号的 检测。 蛋白质芯片的制作原理有多种,片基可采用尼龙膜、聚 丙烯酰胺凝胶、玻片、硅片和金片等 芯片制作系统 芯片制作系统主体 4针机械手从384孔板中取样 48针的机械手进行点样（48针机械手可以在 6小时内对50个具有1,000点样点的芯片进行点样） 针状点样枪头： 点样针点样示意图 操作控制板 洗涤/干燥台 信号检测系统 扫描软件的主操作界面 抗体芯片 抗体芯片的称谓来源于免疫学角度,由于其在微生物感染 检测中巨大的潜在应用价值而引起人们广泛的兴趣,是蛋 白质芯片研究中进展速度较快的一个分支。 抗体芯片：生物样品蛋白表达的抗体芯片完整系统的作 用是用于比较两个生物样品，检测两者蛋白表达的相对 差别。 抗体芯片由数百个按一定顺序共价结合在载玻片上的单 克隆抗体组成。 由细胞单克隆产生的单一构型的蛋白，这些抗体能够大 量产生，而且对可以在细胞表面发现的特定目的抗原具 有特异的亲和力，这些抗原往往是恶性的。 抗体芯片优点： 1.可以通过同时比较数百种蛋白，使特定蛋白与我们感 兴趣的生理和病理过程发生关系。 2.使用单克隆抗体准确性高，敏感度高，专一性强。 3.单克隆抗体的使用时芯片制作只需知道其DNA序列。 4.通用性。 抗体芯片的应用： 不同蛋白表达的测定 ； 毒性检测； 疾病研究，诊断筛选； 癌症研究； 药物开发等。 Ab Microarray 380(Cat.No.K1847-1)----Clontech公 司第一个商业化抗体芯片 * * * * 特点: 整个分析过程可以在一天内完成 用荧光分析的方法比较两个样品之间378个蛋白质的相 对丰度 适用于包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品 试剂盒提供完整的样品抽提制备、标记、孵育所需的 Buffer，特别设计的样品制备的过程能保持样品的完 整 性和溶解性，保证制备样品具有代表性和一致性。 * 芯片上的抗体包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、 细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关 蛋白，跨度大、适用范围广。 * 芯片上的抗体分别经过特异性抗原、细胞系和组织的检 测，灵敏度高达pg/ml * 开放性的芯片平台设计，可以用各种型号DNA芯片荧 光扫描仪进行检测。 Ab Microarray 380上抗体，涉及信号传导、肿瘤发生、 细胞周期调控、细胞结构和神经生物学等广泛领域，不 仅可以识别人源的蛋白而且对小鼠和大鼠样品同样有效。 抗原的标记方法： 同位素标记 荧光标记 化学发光标记 荧光标记类型： A 直接荧光标记 B 半抗原标记 C 抗体夹心法标记 抗体芯片操作原理示意图 整个操作流程包括： 1.从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提； 2.用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样 品； 3.洗去多余的标记分子； 4.与芯片杂交孵育； 5.扫描分析结果。 整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成，操 作者只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱（处理体 液样品时用）和荧光扫描仪，其他的试剂全部由试剂盒 提供。 注意： 1.抗原—抗体结合效率差异 2.不同荧光分子的标记效率差异（Cy5 标记的样品信号偏高） ————内源标准化处理 内源标准化处理是指对两个样品（A、B）中分 别用两种荧光标记分子（Cy3和Cy5）标记，并 交叉与芯片杂交（A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和 B-Cy5一组分别和芯片杂交） 结果分析： 抗体芯片——荧光扫描仪扫描——软件处理——内源 标准化信噪比（Internally Normalized Ratio ，INR） 原理： 芯片1 —— Ratio 1 = A-Cy5/B-Cy3 芯片2 —— Ratio 2 = B-Cy5/A-Cy3 INR 当INR值>1, 说明某抗原在A样品中的量大于其在样品 B中的量，当INR值< 1, 说明某抗原在A样品中的量小 于其在样品B中的量。 尽管INR值优化了我们的结果，只有我们自己才能决定 具体多大或者多小的INR值才是指示蛋白丰度的有效数 据。一般情况下，在我们的实验中INR值 2.0 或者 0.5 时表明抗原蛋白丰度在两样品中有很大的可能性 具有差异性。1.5左右或者低于该值，也是可以接受的， 但是可信度稍低。 对于某种抗体在两样品中具有明显差异的抗原，通过 ELISA平行实验进行验证